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硝化作用对生物地球化学氮循环有重要意义，其中酸性土壤硝化过程的微生物学机理研究一直是氮循环领域的难点。主要原因是酸性土壤中NH3分子浓度极低，一般处于nM水平，极大地限制了微生物氨氧化，其中的主导氨氧化微生物也一直没有定论。同时，酸性土壤氨氧化也是农业生产实践的热点问题，据估算地球30％以上的土壤偏酸性(pH＜5.5)，而一半以上的酸性土壤属于农业土壤或具有潜在的农业价值。氮肥施用极可能改变土壤氮循环并产生负面的生态环境影响，也对氨氧化微生物的群落演化有一定的影响。通过脲酶催化水解产生氨分子进行硝化作用，已被证明是氨氧化细菌(AOB)适应酸性环境的一种机制。然而，迄今尚无证据表明氨氧化古菌(AOA)通过尿素水解参与土壤氨氧化过程。另外，长期施肥对酸性土壤中活性氨氧化古菌的影响也很少有相关研究。 本研究采用普通PCR、实时荧光定量PCR、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、克隆文库构建及测序、454高通量焦磷酸测序等分子生物学技术，并结合稳定性同位素核酸标记示踪技术(DNA-SIP)和15N同位素富集法等方法，深入地揭示了在复杂酸性土壤中主导的氨氧化微生物类群及其生理代谢特征和适应机制、不同生态因子对酸性土壤氨氧化微生物的影响、施肥处理对酸性土壤中氨氧化微生物的定向选择效应造成的生态位分异现象。本论文的主要研究内容和结论如下: 1.本研究采用15N同位素富集法测定分析茶园土壤(pH=3.75)和森林土壤(pH=5.4)两种酸性土壤硝化活性，结果表明其都能够利用尿素进行硝化作用。随后的培养实验表明，加入尿素显著提高促进硝化活性并且AOA的数量也随之增加，而AOB的amoA和16S rRNA都没有检测到。高通量测序结果更在群落水平上证明了在加入尿素处理的土壤中，AOA的比例显著增加，这些结果初步表明AOA可能主导了酸性土壤的氨氧化过程。随后，通过DNA-SIP培养对酸性土壤中功能活跃的氨氧化微生物进行了13C标记，结果表明，13C-DNA中有大量的AOA被富集，同时，古菌的ureC基因在13C-DNA中成功的扩增出来，且在C2H2硝化抑制的处理中没有检测到。说明含有脲酶基因的化能自养AOA主导了两种酸性土壤的氨氧化过程。主导AOA的系统发育水平分析表明其隶属于海洋分支Group1.1 a-associated，DGGE图谱也进一步证明该条带亮度在加入尿素后显著增加。以上结果也表明脲酶催化水解机制使得AOA在酸性土壤中有更强的适应性，但AOA如何在细胞水平利用此代谢机制仍需要进一步研究。 2.通过不同pH的磷酸缓冲液调节森林和茶园土壤的pH值，研究发现其主导氨氧化微生物AOA只能在酸性环境(pH:4.0～4.5)中进行氨氧化作用，在中性和碱性环境(pH:7.0～7.5)中无法进行氨氧化，推测这两种酸性土壤中主导氨氧化微生物AOA的专性嗜酸性。另外，研究还评价了风干作用对酸性土壤中氨氧化微生物的群落结构的影响，结果表明新鲜土壤风干处理后，微生物群落结构产生很大的变化，不同门水平的微生物变化趋势显著不同。但风干作用对氨氧化微生物的群落结构影响较小，仍能反映出加入外来氮源对AOA群落的影响和其在总微生物中比例变化趋势。 3.本研究针对江西进贤长期定位试验站的酸性红壤，在20年的时间尺度下，结果表明施肥处理氮磷钾(NPK)土壤的硝化潜势高于未施肥(CK)土壤，NPK土壤中AOB的数量显著高于CK处理，但AOA的数量没有显著差异。两种土壤中AOA和AOB的群落结构也没有显著差异。然而，在2个月时间尺度加入尿素的DNA-SIP培养，通过对活性微生物的13C-DNA分析表明，CK土壤中的隶属于Group1.1a的AOA主导了其硝化过程，而NPK土壤则由隶属于陆地分支Group1.1b的AOA主导了其硝化过程;且在13C-DNA中都能检测到古菌ureC基因;两种土壤中的活性AOB类群没有变化。另外，短期DNA-SIP培养表明，NPK施肥促进了AOB的活性，抑制了AOA的活性。说明长期施肥已经导致氨氧化微生物发生了功能的分异和活性的改变，影响了其演化方向。 4.本研究比较分析了三种土壤微生物细胞提取方法对酸性森林和茶园土壤的提取效率，以及对微生物群落结构的影响。通过高通量测序结果分析表明，提取出的微生物细胞基本可以反映出原始土壤中微生物多样性，但是群落结构却显著不同。结果表明，蔗糖密度梯度离心结合Nycodenz密度梯度离心既可以得到相对较高的提取效率(＞25.4％)，且细胞纯度较高;差速离心提取效率最低。另外，提取出的细胞可以反映出原始土壤中的氨氧化微生物群落组成和相对丰度，但DGGE图谱表明不同提取方法对氨氧化古菌群落结构有一定的影响。 综上所述，对酸性土壤中的氨氧化过程中的主导微生物及其适应机制研究可归结为三个要点:(1)在酸性土壤的低NH3环境下，具有对NH3亲和力较强的AOA比AOB更能适应酸性环境;(2)具有脲酶活性的AOA，可能通过脲酶催化水解尿素生成NH3直接进行氨氧化过程，这一适应机制使其在酸性土壤中保持较强的硝化活性;(3)长期施肥和不施肥导致的高氮和低氮环境，使得AOA类群产生功能和生态位的分异，Group1.1a的AOA可能更适应低氮环境，Group1.1b则反之;AOB在高氮环境中的活性高于AOA。总之，以上结果对酸性土壤中的硝化过程的研究具有重要意义，对调控酸性土壤氮肥利用效率、制定合理的耕作管理策略保证农田生态系统的良性氮循环有重要参考价值。