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目的
1、根据抗原-抗体免疫反应原理,制备ATC-IC,为进一步将ATC-IC作为肿瘤抗原物质致敏DC做好准备。
2、通过检测DC负载ATC-IC后的表型及分泌因子变化情况,探讨ATC-IC对DC生物学功能的影响。
3、通过检NDC负载ATC-IC后激活的CTL对肿瘤细胞的杀伤率的影响,评价DC负载ATC-IC后诱导的抗肾癌免疫效果情况。
方法
1、用5-氟尿嘧啶诱导肾癌细胞凋亡,获取凋亡肾癌细胞后与G250单抗结合,形成复合物ATC-IC后,用其致敏iDC,未致敏iDC为对照组。
2、用流式细胞仪检测DC负载ATC-IC后其表面分子CD83、CD86、CD80及HLA的变化情况。
3、ELISA试剂盒检测DC分泌IL-12和IFN-γ等细胞因子的量的变化。
4、MTT法检测DC负载ATC-IC后对T淋巴细胞增殖反应的影响。
5、CCK-8检测DC负载ATC-IC后激活的CTL对肿瘤细胞的杀伤活性。
结果
1、获取凋亡的肿瘤细胞,G250单抗与凋亡细胞表面的G250抗原特异性结合,形成复合物ATC-IC。
2、DC的表型变化
相对于负载ATC、G250单抗和未负载的DC,负载ATC-IC的DC疫苗显著上调CD86、CD80、CD83和HLA的表达(42.04%vs28.34%、33.77%、26.52%,P＜0.05;38.17%vs23.79%、31.94%、24.32%,P＜0.05;79.39%vs69.06%、74.49%、66.71%,P＜0.05;35.52%vs26.90%、29.45%、27.42%,P＜0.05),以CD86的上调最为显著。
3、DC分泌细胞因子情况
各组DC培养7-9d后,双抗体夹心ELISA法检测培养上清结果提示,IL-12、IFN-γ分泌水平均上调(25.04vs5.27、13.32、7.53,P＜0.05;63.23vs51.74、52.43、49.04,P＜0.05)。
4、T淋巴细胞增殖反应
以各组mDC为刺激细胞,分离培养的T淋巴细胞为效应细胞,两者以1:1、1:10、1:50及1:100的比例共培养48h后,测量各组异体T细胞增殖结果显示,各组mDC均能刺激T淋巴细胞的增殖,以ATC-IC致敏组mDC刺激T淋巴细胞增殖能力最显著(P＜0.05),并且效靶比在1:10时刺激能力最强(4.02±0.13vs1.73±0.09、1.22±0.10、1.41±0.12,P＜0.01)。
5、CTL对肾透明细胞癌细胞的杀伤活性
(1)不同效应细胞间差异有统计学意义(P＜0.05),以DC+ATC-IC组杀伤活性较高,单独T淋巴细胞对照组杀伤率最低;
(2)不同效靶比间差异有显著性意义,杀伤活性随效靶比的增大而增强,杀伤率由高到低依次为20:1、10:1、5:1、2.5:1,差异具有统计学意义(P＜0.05);
(3)DC+ATC-IC组诱导的CTLs对肾透明细胞癌细胞786-0的杀伤活性高于肺腺癌细胞A549,差异具有统计学意义(P＜0.05)。
结论
1、5-氟尿嘧啶诱导出的凋亡肾癌细胞,与G250单抗可特异性结合形成复合物ATC-IC。
2、ATC-IC致敏DC后,可上调DC表面分子表达水平,促进细胞因子的分泌,并有效的刺激异体T淋巴细胞的增殖。
3、DC负载ATC-IC后诱导的CTLs杀伤肿瘤细胞的能力增强,且对靶细胞的杀伤作用具有一定的特异性。