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背景和目的游离SiO2粉尘所致矽肺的发病机制尚不清楚,缺乏有效的治疗措施。既往研究发现矽肺发生发展中存在机体细胞免疫、体液免疫以及固有免疫功能的异常变化,但所观察的免疫效应细胞限于肺泡巨噬细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞等。树突状细胞（dendritic cell,DC）是机体免疫反应中处于中心调控作用的免疫细胞,其在矽肺中的作用和机制的研究却鲜见报道。本课题组前期研究发现大鼠外周血源性DC体内、外均可被游离SiO2粉尘抑制成熟,影响Th1/Th2分化而致机体免疫改变,但对体内最重要来源之一的髓源性DC未作相应观察。为全面了解DC与游离SiO2粉尘致病作用的关联性及相关效应,以便进一步阐释矽肺发生发展的免疫学机制,建立了大鼠骨髓源性DC数量足够且状态稳定的培养方法,观察游离SiO2粉尘刺激对髓源性DC表型和功能的影响,并对煤工尘肺病人外周血中DC及其Treg、Th1/Th2的分布进行了检测。材料与方法1.游离SiO2粉尘刺激的大鼠髓源性DC对T细胞分化影响的体外观察系列浓度细胞因子诱导大鼠髓源性DC表型和功能特征观察:以系列浓度细胞因子诱导骨髓前体细胞生成髓源性DC,倒置相差显微镜观察DC形态,流式细胞术检测DC收获率、表型,荧光微球实验检测DC吞噬功能,混合淋巴细胞反应检测DC抗原提呈功能。促成熟剂对大鼠DC表型和功能特征作用观察:以TNF-α和LPS分别刺激大鼠未成熟DC（imature DC,iDC）48 h后,倒置相差显微镜观察DC形态,流式细胞术检测DC表型,荧光微球实验检测DC吞噬功能,混合淋巴细胞反应检测DC抗原提呈功能,酶联免疫吸附实验检测细胞上清中细胞因子浓度,蛋白免疫印迹技术检测细胞成熟相关蛋白水平。游离SiO2粉尘刺激对成熟DC表型影响观察:采用CCK8实验检测游离SiO2粉尘对肺泡巨噬细胞（alveolar macrophage,AM）、未成熟DC（iDC）和成熟DC（mature DC,mDC）活性的影响,确定最佳染尘浓度。利用Transwell细胞培养板建立AM和mDC共培养模型,设置直接对照组（mDC组）、间接对照组（AM/mDC组）、直接刺激组（SiO2+mDC组）和间接刺激组（SiO2+AM/mDC组）,游离SiO2粉尘刺激48 h后,流式细胞术检测DC表面分子MHCⅡ、CD80和CD86表达水平。游离SiO2粉尘刺激对iDC成熟转化影响观察:采用直接和间接刺激方式,以游离SiO2粉尘和TNF-α先后刺激iDC,流式细胞术检测DC表面分子MHCⅡ、CD80和CD86表达水平。染尘DC对T细胞影响观察:将染尘DC与T细胞共培养,流式细胞术检测Th1（CD4+IFN-γ+）、Th2（CD4+IL-4+）及Treg（CD4+CD25+）细胞数量,计算Th1/Th2比值。2.煤工尘肺病人外周血DC及T细胞各亚群分布检测选取流行病学调查现场,纳入煤工尘肺病人31例为病例组,观察对象43例为对照组,收集外周血,流式细胞术检测DC、Th1、Th2和Treg数量,计算Th1/Th2比值。分别以DC对Treg、Th1/Th2作相关分析,考察DC水平改变对Treg、Th1/Th2影响。3.统计学分析采用SPSS 21.0进行数据统计分析。计量资料以?±s表示,两组样本间差异的比较采用Student?t检验,多样本间差异的比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验,两变量关系采用Pearson线性相关分析;计数资料样本间差异比较采用?2检验。检验水准α=0.05。结果1.游离SiO2粉尘刺激的大鼠髓源性DC对T细胞分化影响的体外观察系列浓度细胞因子对大鼠髓源性DC表型和功能影响:采用GM-CSF+IL-4培养大鼠骨髓前体细胞6?8 d,收获iDC。随着细胞因子浓度增加,DC收获率、MHCⅡ类分子阳性率和DC表面共刺激分子CD80、CD86表达水平均增高,DC刺激T细胞能力、荧光微球吞噬能力增强（P<0.05）。促成熟剂对大鼠髓源性DC表型和功能影响:TNF-α和LPS均能促进大鼠iDC向mDC转化,获得稳定状态DC。与iDC相比,促成熟剂刺激后的DC高表达MHCⅡ、CD80和CD86,促炎性细胞因子IL-12分泌能力、刺激T细胞能力均增强,细胞吞噬能力减弱;蛋白定量检测发现,DC成熟伴随着细胞内血红素加氧酶（HO-1）表达抑制（P<0.05）。游离SiO2粉尘刺激对髓源性DC表型影响:CCK8染毒实验确定游离SiO2粉尘对AM、iDC和mDC最佳染尘浓度100μg/mL。与相应对照组相比,游离SiO2粉尘直接刺激组和间接刺激组DC表面MHCⅡ、CD80和CD86表达降低（P<0.05）。iDC先后暴露于游离SiO2粉尘和TNF-α后,DC表面MHCⅡ、CD80和CD86表达下调（P<0.05）。染尘DC对T细胞分型影响:染尘DC与T细胞共培养48h后,直接刺激组Th1细胞较相应对照组数量减少,Th2、Treg细胞数量增加,Th1/Th2比值下降（0.81±0.12 vs.1.40±0.10,2.81±0.12 vs.1.83±0.15,28.77±1.81 vs.14.23±2.67,0.29±0.04 vs.0.77±0.08,P<0.05）;间接刺激组Th1细胞数量下降,Th2、Treg细胞数量增加,Th1/Th2比值下降（0.87±0.08 vs.1.50±0.08,3.01±0.19vs.1.65±0.08,30.57±3.85 vs.18.10±1.74,0.29±0.04 vs.0.91±0.05,P<0.05）。2.DC、Th1、Th2和Treg细胞在职业接尘人群中的分布病例组DC、Th2和Treg细胞数量均高于对照组（0.83±0.30 vs.0.62±0.18,2.12±0.61 vs.1.31±0.05,3.30±1.05 vs.2.10±0.87,P<0.05）,Th1/Th2细胞比值低于对照组（4.62±1.43 vs.7.37±2.05,P<0.05）;两组间Th1细胞数量差异无统计学意义（P>0.05）。相关分析提示,外周血中DC数量与Th1/Th2比值负相关（r=-0.656,P=0.003）,与Treg数量正相关（r=0.597,P=0.009）。结论1.体外条件下,游离SiO2粉尘可能通过抑制大鼠髓源性DC的成熟影响T细胞分化。2.煤工尘肺病人外周血存在DC、Treg数量改变和Th1/Th2偏移,且DC的改变与Treg和Th1/Th2的变化具备相关关系。