论文部分内容阅读
本文以葡萄酒酵母(Saccharomyces ellisoideus)1450及西北农林科技大学葡萄酒学院优选的酒类酒球菌(Oenococcus oeni)SD-2a为亲株，应用原生质体融合技术，进行了构建葡萄酒降酸酵母的研究，得到了以下结果：1.对于酒类酒球菌SD-2a，当菌液OD600≈0.6时，菌体处于对数生长中期，细胞浓度约为3×109个/ml，采用菌体细胞，以SMM为渗透压稳定液，溶菌酶酶解浓度为1mg/mL，于37℃水浴酶解30min，原生质体形成率达98.2%，再生率达15.9%。2.对于葡萄酒酵母1450，当细胞浓度在2～3×107个/ml时，菌体处于对数生长中期，采用菌体细胞，经0.3%β-巯基乙醇-0.1%EDTANa2于37℃预处理10～15min，再以PBS为渗透压稳定液，蜗牛酶浓度为2%，于37℃水浴酶解40min，原生质体形成率达96.9%，再生率达16.1%。3.SD-2a木糖发酵试验结果表明，在其它培养条件相同的情况下,SD-2a在以木糖为碳源的培养基中的长势远不及在以葡萄糖为碳源的培养基中的长势,这说明SD-2a不具备或丧失了木糖发酵能力。4.取葡萄酒酵1450对数生长中期的细胞,浓度调至2～3×108个/ml,涂YPD平板。7.5mg/L的两性霉素B对其生长无明显抑制作用；在含500u/ml制霉菌素的平板上，三天内无菌落出现，继续培养则逐步出现抗性菌落；在含50ug/mL放线菌酮的平板上，连续培养5天后，平板中有少数抗性菌落出现，在含100ug/mL放线菌酮的平板上，连续培养7天以上，平板中亦无抗性菌落出现。5.本实验采用PEG-4000 30%(w/v)、融合温度 30℃、融合时间 30min、酵母细胞数/乳酸菌细胞数 1/100、Cacl2浓度 50mmol/L的融合条件，以经过PEG处理的酵母细胞为对照，以100ug/mL放线菌酮＋20ug/mL氨苄青霉素作为融合子筛选的选择压力，在连续培养9天后，共获得了117株菌落形态类似葡萄酒酵母1450的融合子。经目标融合子筛选试验，获得了一株具备较强苹果酸降解力的融合子F-20。6.融合子F-20经单细胞分离培养，从20个单细胞中，筛选出一株生活力较强的单克隆菌株F-20-7，其细胞形态、大小、菌落特征均与葡萄酒酵母1450相似。7.融合子F-20-7发酵试验表明，F-20-7可在酒精发酵的同时降解苹果酸，其酒精发酵能力接近葡萄酒酵母1450；苹果酸降解能力介于两亲株之间，相对接近酒类酒球菌SD-2a。