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以TGF-β、CTGF为代表的细胞因子在肾小球硬化过程中起重要作用，拮抗细胞因子的不良作用已成为防治肾小球硬化、延缓肾小球疾病进展中的重要环节。因此，加强对肾小球硬化相关细胞因子通路的研究是了解肾小球硬化机制，探索新的治疗方法和手段的重要途径。蛋白酪氨酸激酶（Janus Kinases／Just another Kinases，JAK）／信号传导子和转录激活子（signal transducers and activators of transcription，STAT）信号通路是一重要的细胞因子信号传导通路。在肾小球硬化过程中的不同阶段，炎症因子和肾小球硬化相关细胞因子的释放、ECM产生、肾固有细胞的活化及表型转化可能有不同的JAKs／STATs信号通路参与，目前尚无该方面的研究报道，本研究将探寻JAKs／STATs信号通路在肾小球硬化的作用，为进一步揭示肾小球硬化的生物学机制提供理论依据。苦参是甘肃省的道地药材，系药用豆科槐属植物苦参（Sophora flavescens Ait）的干燥根，性寒味苦，具有清热燥湿，利尿的功效，始载于我国最早的药学文献《神农本草经》。苦参碱（matrine）和氧化苦参碱（oxymatrine）化学分子式分别为C15H24N2O和C15H24N2O2，分子量分别为266和282，是苦参的主要活性成分，二者在一定条件下可以转化，有多方面的药理作用和功效，如抗炎、消肿利尿、免疫及生物反应调节作用等。近年来研究发现，苦参碱或氧化苦参碱具有抗肝脏纤维化和皮肤纤维的作用。导师课题组前期研究工作已经从细胞实验和在体动物实验证实苦参碱在防治肾脏纤维化有一定作用。但其对肾小球硬化相关信号通路的影响和作用机制尚不十分清楚，为进一步探讨苦参碱防治肾脏纤维化的作用机理，本研究拟通过在体动物实验，探寻苦参碱对JAKs／STATs信号通路在阿霉素肾小球硬化大鼠中的作用。更加深入的了解苦参碱的作用机理，为开发新的防治肾纤维化的临床药物提供基础研究依据。第一部分JAKs／STATs信号转导通路及其内源性抑制分子在肾小球硬化大鼠肾组织中的表达目的：动态观察肾小球硬化大鼠模型病理变化过程中JAKs／STATs信号转导通路分子和内源性抑制分子SOCS、PIAS的表达，探讨肾小球硬化中JAKs／STATs信号转导通路分子和内源性抑制分子SOCS、PIAS的作用和可能机制，为进一步开展防治肾小球硬化研究提供实验依据。方法：60只wistar大鼠随机分为两组：模型组和正常对照组。模型组采用右侧肾切除加1周后尾静脉注射阿霉素（5mg／kg）的方法建立肾小球硬化大鼠模型，设假手术组为正常对照组。2、4、6周分批处死每组各10只大鼠，检测24小时蛋白尿、血清肌酐和尿素氮的变化，免疫组化检测肾脏COL-Ⅳ、α-SMA表达，以确定成功制备肾小球硬化大鼠模型。采用免疫组化检测肾脏STAT1、STAT3的定位表达，western-blotting检测STAT1、P-STAT1、STAT3、P-STAT3蛋白的定量表达，采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术观察JAK1、JAK2、STAT1、STAT3、SOCS1、SOCS3、PIAS1、PIAS3mRNA表达。结果：1．与对照组相比，模型组血清肌酐、尿素氮和24小时蛋白尿从2周起逐渐增高，至第6周明显高于对照组（P＜0.01）。组织病理学染色观察，模型组大鼠肾组织出现肾小球系膜基质中度增多，伴局灶节段性肾小球硬化，部分肾小球球囊粘连，肾间质可见炎性细胞侵润。肾小球硬化指数明显高于对照组（P＜0.01）。模型组COL-Ⅳ、α-SMA表达明显高于对照组及试验组（P＜0.05），呈逐渐升高趋势；满肾小球硬化大鼠模型制备成功。2．Western-boltting结果显示，模型组STAT1、P-STAT1蛋白随着病程的发展表达逐渐增高，第4、6周时同对照组相比差异有显著意义。STAT3、P-STAT3蛋白在第2周时表达增高，同对照组相比差异有显著意义，随后其表达逐渐降低。3．经荧光定量RT-PCR反应结果显示，模型组JAK2mRNA的表达在第2、4周显著降低，于第6周增高，且较对照组相比差异具有统计学意义。模型组STAT3mRNA的表达呈现出在第2周时显著增高随后表达逐渐降低的趋势。模型组JAK1，STAT1，PIAS1mRNA的表达呈现出先增高后降低，再逐渐增高的趋势，且较对照组相比差异具有统计学意义。模型组SOCS1、SOCS3、PIAS3mRNA的表达在疾病过程中始终低于对照组，差异具有统计学意义。结论：1．JAK／STAT信号转导通路分子家族在大鼠肾小球硬化模型中的表达是不同的。不同的信号分子在肾小球硬化的早、中、晚期表达趋势并不相同，说明在肾小球硬化过程中激活该通路的细胞因子以及调节因素不同，各自对肾小球硬化的病理过程的形成起重要作用。2．内源性抑制分子SOCS和PIAS家族在肾小球硬化过程中也有重要的作用，它们在不同的病理阶段表达不同，调节STAT分子的活化，它们的表达不足和过表达可能与肾小球硬化发展有关。第二部分苦参碱对肾小球硬化大鼠肾组织JAKs／STATs信号转导通路分子及其内源性抑制分子影响的研究目的观察苦参碱对阿霉素诱导的肾小球硬化大鼠JAKs／STATs分子变化的影响，探讨苦参碱防治肾小球硬化的机制。方法雄性SPF级Wistar大鼠90只，体重180-200g，随机分成3组：对照组（假手术组）30只、模型组30只，苦参碱治疗组（苦参碱注射液肌肉注射25mg／kg．d）30只。检测各组术后第6周的尿蛋白、血清尿素氮、肌酐及肾组织病理改变，并应用免疫组织化学方法检测COL-Ⅳ、α-SMA、STAT1和STAT3蛋白质在肾皮质组织中的表达，以确定肾小球硬化模型的成功及苦参碱的防治效果。采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术观察JAK1、JAK2、STAT1、STAT3、SOCS1、SOCS3、PIAS1、PIAS3mRNA表达。结果1．苦参碱治疗组的尿蛋白排泄量、血肌酐和尿素氮水平均低于模型组，肾小球硬化程度轻于模型组（P＜0.05），肾皮质COL-Ⅳ、α-SMA蛋白表达也低于模型组（P＜0.05）。2．苦参碱治疗组的STAT1蛋白水平于2周末高于模型组，在6周低于模型组（P＜0.05），STAT3蛋白表达在个时间段均低于模型组（P＜0.05）。3．经荧光定量PCR反应结果显示，和模型组相比苦参碱治疗组JAK2、STATI、STAT3、PIAS1mRNA表达降低，SOCS1、SOCS3、PIAS3mRNA表达显著增高结论苦参碱对肾小球硬化大鼠模型肾脏病变有部分防护作用。苦参碱对肾小球硬化的防治是通过抑制JAK2、STAT1、STAT3、PIAS1分子，和增加SOCS1、SOCS3、PIAS3的表达起作用的。