亚细胞区域内RNA结合蛋白的高通量质谱鉴定

• 作 者: 严帅
• 出 处: 天津医科大学
• 发表日期: 2020年01期
• 关键词: RNA结合蛋白 质谱 代谢酶 RNA结合区域

研究背景和目的:RNA结合蛋白(RNA-binding proteins,RBPs)与RNA之间的相互作用在基因表达调控及很多其他生物过程中发挥着重要作用。多种疾病的发生与RBPs功能异常密切相关。未知RBPs的发现对研究RNA参与的生物过程及其分子机制具有重要意义。目前已有的多种RBPs鉴定方法存在一定的局限性,不能完全满足RBPs高通量鉴定的敏感性和准确性的要求。因此,我们在本研究中结合紫外交联、亚细胞结构分离、AGPC(acidic guanidinium-thiocyanate-phenol-chloroform)双相萃取和定量质谱检测建立一种RBPs鉴定方法,可用于不同亚细胞空间中RBPs及其RNA结合区域的鉴定。研究方法:我们建立了一种RBPs鉴定方法SFABE(subcellular fraction and AGPC biphasic extraction),通过紫外交联、亚细胞结构分离和AGPC双相萃取技术提纯细胞核和细胞质RBPs,并利用液相色谱串联质谱(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析RNA结合蛋白组。首先,我们比较SFABE RBPs和其他高通量RBPs鉴定方法的结果,并分析RBPs分子特性,包括等电点、分子质量和疏水性。其次,我们对不同亚细胞区域内RBPs进行基因本体论(Gene ontology,GO)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes)功能通路分析。最后,为了验证SFABE方法的可靠性,我们利用紫外交联辅助western blotting对6个新发现的RBPs进行结合活性验证。此外,我们还通过提纯、检测交联位点相邻肽段,并在计算机上推断出相应的RNA结合区域,实现对RNA结合区域的高通量鉴定。结果:使用SFABE方法,在人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞核和细胞质中分别鉴定到1783和2251个RBPs。SFABE RBPs包含超过2/3 GO注释的RBPs,并在很大程度上与其他高通量方法的鉴定结果重叠。生物信息学分析结果表明SFABE RBPs在RNA相关功能通路显著富集。此外,我们发现202个RBPs作为代谢酶参与多种代谢途径,包括糖、氨基酸及脂类代谢。紫外交联辅助western blotting结果显示,6个被鉴定为RBP的代谢酶都具有RNA结合能力。我们在1090个蛋白质中鉴定到2873个RNA结合区域,其中710个位于已知RNA结合域(RNA-binding domains,RBDs),1160位于未知结构域,1003位于固有无序区域(Intrinsically disordered regions,IDRs)。结论:我们建立了一种高通量鉴定RBPs的方法—SFABE,可以提纯和鉴定亚细胞区域内的RBPs。利用该方法,我们确证了许多早期报道的RBPs,并发现数百种新的RBPs。细胞不同区域内的RBPs显示出不同的生物学功能。我们的发现显著增加了RBPs的数量,并证明了许多代谢酶的RNA结合能力。此外,我们还鉴定到2873个RNA结合区域,为RNA-蛋白质相互作用提供了重要的结构信息。