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苦参碱是从我国传统中药材苦参中提取出的一种生物碱活性成分,它已被证明对一些癌细胞株具有抗恶性细胞增生、促进细胞凋亡和抑制细胞浸润的特性。虽然有研究表明苦参碱对多种癌细胞株具有抑制细胞增生、促进细胞凋亡和抑制细胞浸润的特性,但有关其在雄激素非依赖性前列腺癌中的治疗效果和作用机制的研究仍较少。本文研究了苦参碱对雄激素非依赖性前列腺癌DU145和PC-3细胞株增殖、迁移、浸润、细胞周期和凋亡的影响,并通过高通量测序技术、生物信息学方法、荧光定量PCR技术和免疫印迹方法研究探索其在这些细胞株中潜在的抗肿瘤活性的机制,目的是为雄激素非依赖性前列腺癌的治疗寻找新的策略。[目的]本研究拟探索苦参碱对雄激素非依赖性前列腺癌DU145和PC-3细胞的治疗效果和作用机制。[方法](1)通过MTS实验检测苦参碱对DU145和PC-3细胞的抗肿瘤细胞生长作用,采用Transwell实验检测苦参碱对DU145和PC-3细胞的抗肿瘤细胞迁移和侵袭作用。(2) DU145和PC-3细胞株在体外培养24h,用苦参碱/对照血清同时干预48h,提取细胞总RNA。使用Illumina公司开发的Hiseq 2500高通量测序平台对提取的细胞总RNA测序,建立基因文库,并进行Reads数据质量统计,利用DAVID网站整合数据库对2倍法筛选的差异基因进行基因本体学和KEGG信号通路分析。(3)通过流式细胞分析方法检测苦参碱对DU145和PC-3细胞细胞周期和细胞凋亡的影响。(4)通过免疫印迹的方法检测苦参碱对DU145和PC-3细胞P65、pP65、IKKα/β、pIKKα/β、IKBα和p-IKBα蛋白表达的影响。(5)通过实时定量PCR方法检测苦参碱对DU145和PC-3细胞FOXO1A、FOX03A、FOX04、FOX06和PI3K基因表达的影响。通过免疫印迹的方法检测苦参碱对DU 145和 PC-3 细胞 FOXO1A、FOX03A、FOX04、FOX06 和 PI3K 蛋白表达的影响。[结果](1)苦参碱能够有效的抑制雄激素非依赖性前列腺癌细胞株DU145和PC-3的生长、迁移和浸润,这种作用随治疗剂量的增加和治疗时间的延长而增强。(2)通过高通量测序、生物信息学软件分析和GO分析发现,用药前后差异基因主要在细胞代谢(metabolic process)、细胞发育(growth process)、结构发育(anatomical structure formation )、细胞组织构成(cel lular component organization )、生物过程调节(biological regulation)等方面具有重要作用。通过KEGG信号通路分析发现具有显著性差异的为NF-κB信号通路、FOXO信号通路和PI3K-AKT信号通路。(3)经苦参碱处理后的DU145和PC-3细胞在DNA合成期(S期)的百分比明显低于对照组,在subG1期的百分比高于对照组。同时,暴露于苦参碱的DU145和PC-3细胞中凋亡细胞群明显增加。(4)通过免疫印迹方法发现经过苦参碱处理后的DU145和PC-3细胞中P65、pP65、IKKα/β、pIKKα/β、IKBα和p-IKBα的蛋白表达水平均有所下降(P<0.01)。(5)通过实时荧光定量PCR技术发现经过苦参碱处理后的DU145和PC-3细胞中FOXO1A、FOX03A、FOX04和FOX06的mRNA表达水平均有所上升(P<0.01或P<0.05),而PI3K的mRNA表达水平有所下降(P<0.01)。通过免疫印迹方法发现经过苦参碱处理后的DU145和PC-3细胞中FOXO1A、FOX03A、FOX04和FOX06的蛋白表达水平均有所上升(P<0.01),而PI3K的蛋白表达水平有所下降(P<0.01)。[结论](1)苦参碱对DU145和PC-3细胞增殖、迁移和浸润均有抑制作用,且呈剂量和时间依赖性。(2)苦参碱对DU145和PC-3细胞的mRNA的表达谱产生了广泛的调控作用。GO分析提示差异基因在细胞发育、调控、死亡和凋亡等方面存在富集。KEGG通路分析提示,NF-κB、FOXO和PI3K-AKT信号通路是苦参碱发挥作用的重要调控通路。(3)苦参碱能够影响DU145和PC-3细胞的细胞周期,抑制DNA合成的过程,促使细胞凋亡,进而起到抑制肿瘤细胞的作用。(4)苦参碱的抗肿瘤作用可能与抑制NF-κB信号通路,抑制PI3K-AKT通路和激活FOXO通路相关。(5)苦参碱有可能成为一种有效的治疗雄激素非依赖性前列腺癌的药物。