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马立克氏病（Marek’s disease,MD）是由马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）引起的肿瘤性疾病,具有较高的发病率和死亡率,严重危害了家禽养殖业。接种疫苗是防控马立克氏病的有力手段,但是马立克氏病病毒毒力不断增强,现有疫苗无法提供完全的保护力。新研发的疫苗虽然能有效防控超强毒力毒株的感染,但是目前的检测技术无法对新研发的疫苗毒和野毒进行区分,市场上亟需新的检测技术为诊断马立克氏病病毒、辅助净化鸡群提供支持。猫疱疹病毒（feline herpesvirus,FHV-I）所致的猫上呼吸道疾病是临床中常见的一种严重的、高度的接触性传染病,常与其他猫病共同危害猫群的生命安全。目前临床上针对多数猫病均未有免疫效果较好的疫苗,疱疹病毒作为新型疫苗研发的工具载体有较好的免疫保护效果和市场应用前景,因此构建猫疱疹病毒重组疫苗对猫用疫苗的研发具有重大意义。基于此,本研究建立了区分马立克氏病疫苗毒和野毒的PCR鉴别检测技术,构建了带有细菌人工染色体元件的猫疱疹病毒重组毒。具体研究结果如下:1.MD疫苗毒和野毒的PCR鉴别检测方法的建立本研究对NCBI Gen Bank数据库上所发表的140余株马立克氏病病毒株序列进行了全基因组分析,确定了马立克氏病CVI988和814疫苗毒相较于野毒（MDV-I）在meq基因位置有177 bp的碱基插入,新研发的疫苗株SC9-1与野毒株相比缺失了meq基因,r MDV-MS-△meq相较于野毒缺失了meq基因的前半部分的468 bp的碱基序列。基于此设计引物并对引物反应条件进行优化,最终建立了区分马立克氏病CVI988、814、SC9-1、r MDV-MS-△meq疫苗毒和野毒的PCR检测方法。以MDV-Ⅰ、814疫苗毒、鸡传染性贫血病毒（CIAV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）、禽白血病病毒（ALV）、鸡包涵体肝炎（IBH）、禽流感病毒（IAV）、新城疫病毒（NDV）、鸡胚成纤维细胞（CEF）基因组为模板进行特异性实验,结果显示仅有MDV-Ⅰ、814疫苗毒有特异性扩增;以MDV-I和814疫苗毒为模板并设置阴性对照进行敏感性检测,结果显示本方法灵敏度均为0.01 ng/μL;以MDV-I和814疫苗毒为模板并设置阴性对照进行重复性检测,结果显示3次重复扩增结果稳定;使用本方法对临床样本进行符合率检测,结果显示本方法阳性样品符合率100%,阴性样品符合率100%。以上结果表明,本研究建立的区分马立克氏病野毒和疫苗毒的PCR检测方法特异性强,灵敏性良好,扩增结果稳定,临床样品检测符合率高。湖南某地种鸡场某3周龄鸡在1日龄免疫后仍表现出疑似马立克氏病的神经症状,但不确定是由野毒还是疫苗毒引起。应用本方法对病死鸡进行诊断,将扩增出的野毒和疫苗毒目的片段分别送测序以验证本方法的准确性。测序结果显示扩增出的目的片段分别与MDV-Ⅰ和疫苗毒株相一致,表明该方法可用于诊断MDV-I并与CVI988、814疫苗株以及SC9-1、r MDV-MS-△meq新研发的疫苗株相区分。2.猫疱疹病毒重组毒（rFHV-g G-/EGFP+）的构建本研究旨在利用CRISPR-Cas9技术精准切割病毒g G基因并利用同源重组将g G替换成BAC相关元件获得重组的猫疱疹病毒。首先,利用慢病毒包装系统构建了表达靶向g G基因sg RNA的CRFK-Cas9细胞系（CRFK-Cas9-sg G）,将含有g G基因两端同源臂的BAC转移载体转染该细胞后,同时以MOI=0.1的感染剂量感染FHV-I,收取细胞盲传后,挑选在Eco-gpt压力筛选下带有绿色荧光的重组病毒。结果表明,CRISPR-Cas9技术的协同作用下于第二次盲传时便获得了重组毒。为了确定该重组毒的正确性,通过PCR鉴定以及将该重组毒基因组转染至真核细胞进行验证,并进一步分析该重组毒的体外生长特性以及遗传稳定性。结果表明,PCR能扩增出与预期相符的目的条带且测序结果与参考序列一致,转染真核细胞能拯救出具有感染性的病毒粒子,表明该病毒正确克隆至BAC载体;该重组毒的体外生长特性与野毒没有明显差异,体外增殖也具有遗传稳定性,表明BAC元件插入猫疱疹病毒基因组US3以及US6之间不影响其体外培养及增殖的基本特性。综上所述,本研究建立了区分马立克氏病CVI988、814以及SC9-1、r MDV-MS-△meq疫苗毒和野毒的PCR检测方法,并将其进行初步应用,可作为新型检测技术进一步开发利用,为马立克氏病的诊断以及鸡群净化提供技术支持。同时构建了带有细菌人工染色体（BAC）元件的猫疱疹病毒重组荧光毒,为猫用疫苗研发建立反向遗传操作平台奠定基础。