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猪的主要组织相容性复合体Ⅰ(SLA-Ⅰ)的重链含有三个功能性基因SLA-1、SLA-2和SLA-3，其表达产物与轻链β2m非共价键结合形成SLA-Ⅰ类分子，在体内结合和递呈抗原表位(epitope)，供T细胞受体(TCR)识别。为了建立猪的重要病毒抗原T细胞表位的筛选系统，首先采用RT-PCR技术从我国地方优势品种巴马小型猪脾脏克隆了SLA-2和β2m基因，然后用pMAL-p2X/E.coli可溶性表达系分别表达了SLA-2的胞外区和β2m的成熟肽；随后，设计了一个富含甘氨酸和丝氨酸的接头linker(G4S)3，采用剪接重叠延伸PCR(splicingoverlapextentionPCR，SOEPCR)技术将SLA-2的胞外区和β2m的成熟肽串联成基因链SLA-2-linker-β2m，再插入pMAL-p2X质粒进行可溶性表达，得到融合蛋白，在通过Amylose树脂亲合层析纯化、FactorXa蛋白酶切、DEAE琼脂糖分子筛过柱，分离纯化得到表达蛋白：SLA-2、β2m和SLA-2-(G4S)3-β2m，采用圆二色谱(CD)测定其二级结构(2D)；并同源模建了SLA-2和β2m蛋白的三级结构(3D)。在此研究的基础上，计算机方法预测并合成了口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白的三类T细胞表位的九肽PepⅠ、PepⅡ和PepⅢ，与SLA-2-(G4S)3-β2m单链复合体蛋白结合，同时设定其它九肽和蛋白的对照试验。结合后的复合体-多肽复合物经分离纯化、酸洗脱等方法从复合物中分离结合的多肽，用质谱仪测定其分子量和氨基酸序列。在质谱测定的基础上，以小鼠为模式动物，采用免疫学方法测定三类口蹄疫病毒T细胞表位九肽的免疫学活性。
序列测定和分析结果表明，从巴马小型猪克隆的SLA-2*bm属于一新的等位基因，而β2m*bm为一已知基因。CD结果表明，SLA-2蛋白呈典型的α螺旋结构，其2D结构成分α螺旋、β折叠、转角和随机蜷曲的含量分别为76、95、36和67个氨基酸；β2m蛋白中分别为0、45、8和45个氨基酸；单链重组蛋白SLA-2-(G4S)3-β2m中分别为78、149、67和93个氨基酸，三者在α螺旋、β折叠的符合率分别达到了97.4％和93.9％。猪SLA-2、β2m蛋白二级结构成分含量与人HLA-A2和β2m的相似。同源模建的SLA-2和β2m3D与人及小鼠的类似。质谱测定结果表明，重建的单链复合体蛋白SLA-2-(G4S)3-β2m在体外可成功结合PepⅠ和PepⅡ，而不能结合其它多肽。多肽的免疫学实验证实，多肽PepⅠ和PepⅡ在模式动物小鼠体内均能诱导肽特异性的T淋巴细胞增殖、外周血CD8+T淋巴细胞增殖和IFN-γ分泌的增加。而PepⅢ的免疫学效果不明显。
本研究在体外成功重建了SLA-2-(G4S)3-β2m复合体鉴定病毒抗原多肽系统，首次鉴定出了SLA-Ⅰ类分子限制性的两类口蹄疫病毒VP1蛋白的T细胞表位，为今后进行SLA-Ⅰ类分子的3D结构研究及新型口蹄疫多肽疫苗的开发和研究奠定了基础。
第二章猪SLA-2和β2m基因的cDNA克隆与序列分析
为研究我国地方优势品种巴马小型猪的MHC分子特征，设计引物，从脾脏克隆了Ⅰ类分子的SLA-2基因和β2微球蛋白基因(β2m)，分别命名SLA-2*bm，β2m*bm。经序列测定，SLA-2*bm为1119bp，3～1097为ORF区，共编码364个氨基酸，含有两对链内二硫键，分别在第125，188，227和283位置出现半胱氨酸残基，基因序列登录入DDBJ/EMBL/GenBank(AB231907)，与猪SLA-2其它登录序列的同源性为88.4％-96.4％，与SLA-3和SLA-1等位基因群的的的氨基酸的同源率分别为88.3％～90.5％和87.7％～92.7％，且保留了人HLA-A2基因的部分功能位点；分子进化树显示SLA-2*bm在遗传关系上与其它SLA-2等位基因较远。β2m*bm基因与Genbank上登录的猪已有β2m序列同源性达到了100％。结果表明，SLA-2*bm为一新的等位基因。
第三章猪SLA-2、β2m以及重构复合体基因链SLA-2-linker-β2m的可溶性表达、二级结构测定
目前，猪的SLA-Ⅰ类限制性的T细胞表位(epitope)测定平台还没有建立。为了建立猪MHC-Ⅰ类体外鉴定T细胞表位平台，分别亚克隆了SLA-2的胞外区和β2m的成熟肽部分，并插入到p2X载体，转化大肠杆菌TB1，在pMAL-p2X可溶性表达系统上进行表达，其表达产物分别为融合蛋白MBP-SLA-2和MBP-β2m。另外，采用剪接重叠延伸PCR(splicingoverlapextentionPCR，SOEPCR)法，通过一富含甘氨酸/丝氨酸的Linker(G4S)3将两个片段连接，形成复合体基因链SLA-2-Linker-β2m全长。SLA-2-Linker-β2m在pMAL-p2X表达系统上表达，其产物为融合表达蛋白MBP-SLA-2-(G4S)3-β2m。融合蛋白MBP-SLA-2、MBP-β2m和MBP-SLA-2-(G4S)3-β2m分别经过了Western-blot鉴定，Amylose淀粉亲和层析柱及DEAE-葡聚糖层析柱进行纯化。纯化后的融合蛋白经过FactorXa切割，再分离纯化得到去除MBP的单体蛋白SLA-2、β2m及SLA-2-(G4S)3-β2m。三个单体蛋白以及麦芽糖结合蛋白(Maltosebindingprotein，MBP)分别经过圆二色谱(circulardichroismspectrum，CD)测定其二级结构；应用EXPASY服务器(http：//www.expasy.ch/tools/)上的SOPMA法预测SLA-2及β2m蛋白的二级结构，并根据人和小鼠的蛋白数据库中MHCⅠ类分子蛋白及β2m三维结晶结构进行了猪SLA-2、β2m蛋白的同源模建。最后结果显示，三个融合蛋白MBP-SLA-2、MBP-β2m以及MBP-SLA-2-(G4S)3-β2m均为可溶性表达，大小分别为74.2kDa、56.3kDa和84.1kDa。切割后去除MBP的单体蛋白大小为29.3kDa,10.6kDa和41.6kDa。圆二色谱分析单体蛋白SLA-2各二级结构成分α-螺旋(α-helix)，β-折叠(β-sheet)，转角(turn)和随机卷曲(randomcoil)所含有的氨基酸数目分别为76，95，36，67；β2m相应的各二级结构成分分别为0，45，8，45；复合体蛋白相应的二级结构成分分别为78，149，67，93，与单体表达的蛋白SLA-2和β2m的二级结构成分中的α-螺旋和β-折叠存在一定的符合率，分别为98.7％和93.9％；复合体蛋白的二级结构图谱显示典型的α-螺旋结构。综合各数据得出结论，该复合体蛋白具有良好的构象，可以用于进行进一步的T细胞表位筛选等研究。二级结构预测显示猪SLA-2、β2m与人HLA-A2、β2m之间的二级结构保守性均大于一级结构之间的保守性；三维晶体结构(3D)的同源模键，猪的SLA-2同人的HLA-A2，以及猪和人的β2m之间均存在一定的相似性，只是在构成各二级结构成分的氨基酸数目、位置等精细结构方面存在差异。
第四章重构蛋白复合体SLA-2-(G4S)3-β2m筛选口蹄疫病毒VP1蛋白T细胞表位
纯化的单链重组蛋白SLA-2-(G4S)3-β2m具有正确的二级结构并保留了进行多肽结合的所需的基本结构区域，为了探讨该复合体是否能够用于结合并用于筛选病毒的T细胞表位，我们通过网站预测和计算机辅助软件，设计并精心挑选了3类口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白的T细胞表位，经过化学合成，分别命名为PepⅠ、PepⅡ和PepⅢ，用以结合单链蛋白SLA-2-(G4S)3-β2m；同时设定非相关蛋白和多肽的对照试验。分离结合多肽后的SLA-2-(G4S)3-β2m蛋白，经酸洗脱，洗掉结合在SLA-2-(G4S)3-β2m蛋白抗原结合槽上的多肽分子，洗脱液利用C18柱脱盐、去酸及更换缓冲液处理，然后将含有多肽的样品于冻干机上冻干，用含肉桂酸的基质溶解后直接点样上质谱进行一级(分子量)和二级(氨基酸序列)质谱的测定，结果显示，纯化的目的蛋白SLA-2-(G4S)3-β2m在体外与FMDVVP1蛋白的其中两类T细胞表位PepⅠ和PepⅡ成功结合，而与PepⅢ、非相关多肽不能结合，对照蛋白MBP的肽结合试验显示阴性。研究结果表明，重构的复合体系统具有肽结合特异性，可以用于筛选和鉴定口蹄疫等病毒的T细胞表位。
第五章口蹄疫病毒三类T细胞表位多肽的免疫学活性测定
为了鉴定口蹄疫病毒VP1结构蛋白新的T细胞表位，设计动物试验测定化学合成的三类T细胞表位多肽的免疫学活性。化学合成的三类多肽PepⅠ、PepⅡ和PepⅢ分别经弗氏佐剂乳化，免疫6周龄BALB/c小鼠。加强免疫后，测定各免疫组小鼠的T细胞增殖反应、特异性CD8+T淋巴细胞的增殖及IFN-γ的增殖指标。结果显示，PepⅠ、PepⅡ组小鼠相对于佐剂免疫组小鼠能够引起显著的T细胞增殖反应、特异性CD8+细胞的增殖及IFN-γ的增殖，其中PepⅡ引起的各类细胞性免疫应答指标最高，而PepⅢ各组指标与佐剂对照组差异不显著(P＜0.05)。本试验鉴定出了两类具有免疫学活性的T细胞表位，为进一步进行口蹄疫新型多肽疫苗的设计奠定了基础。