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第一部分 成人隐匿性自身免疫性糖尿病患者CD4+T淋巴细胞组蛋白H3赖氨酸9甲基化水平的变化及其临床意义目的:成人隐匿性自身免疫性糖尿病(LADA)的发病机制目前尚未完全阐明,研究表明组蛋白甲基化与糖尿病及自身免疫性疾病均相关。本研究的目的旨在探讨LADA患者组蛋白甲基化水平的变化及其临床意义。方法:收集26例LADA患者及26例健康对照者的外周静脉血标本,所有LADA患者均谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)阳性,并根据GADA的滴度分为LADA-1型(高GADA滴度,9例)和LADA-2型(低GADA滴度,17例),根据是否伴有糖尿病微血管并发症将LADA患者分为LADAnc(无糖尿病并发症亚组,12例)和LADAc(伴糖尿病并发症亚组,14例)。利用密度梯度离心法分离出各研究对象的外周血单个核细胞,再用流式细胞仪分选出CD4+T淋巴细胞。使用H3K4甲基化及H3K9甲基化检测试剂盒提取CD4+T淋巴细胞的组蛋白及检测H3K4甲基化和H3K9甲基化水平(ELISA法)。结果:相较于健康对照组,LADA患者CD4+T淋巴细胞H3K9甲基化水平下降(P<0.05),而H3K4甲基化水平在两组间无统计学差异(P>0.05)。LADA患者CD4+T淋巴细胞H3K9甲基化水平下降与GADA滴度相关(r=-0.824,P<0.05),而与糖化血红蛋白A1c无相关性(r=-0.546,P>0.05)。相较于LADA-2型患者,高GADA滴度的LAD A-1型患者外周血CD4+T淋巴细胞H3K9甲基化水平更低,有统计学差异(P<0.05)。LADAc(n=14)与LADAnc(n=12)进行比较,LADAc亚组的H3K9甲基化水平下降更显著(P<0.05)。结论:本研究发现LADA患者外周血CD4+T淋巴细胞中H3K9甲基化水平下降,而且H3K9甲基化水平与GAD A滴度呈负相关,推测这可能是LAD A的发病机制之一。无糖尿病微血管并发症的LADA患者亚组与伴微血管并发症的LADA患者亚组H3K9甲基化水平存在差异,推测低水平的H3K9甲基化是糖尿病并发症发生发展的危险因素之一。第二部分成人隐匿性自身免疫性糖尿病患者CD4+T淋巴细胞组蛋白H3赖氨酸9甲基化改变的机制目的:研究LADA患者外周血CD4+T淋巴细胞的组蛋白甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶的mRNA表达水平,初步探讨LADA患者组蛋白甲基化水平改变的可能机制。方法:收集26例LADA患者和26例健康对照者的外周静脉血标本,利用密度梯度离心法分离出各研究对象的外周血单个核细胞,再用流式细胞仪分选出CD4+T淋巴细胞。提取LADA患者和健康对照外周血CD4+T淋巴细胞的RNA,再使用实时定量PCR法检测其组蛋白甲基转移酶(包括SET1,SUV39H1,SUV39H2和G9a)及组蛋白去甲基化酶(包括 LSD1,KDM3A,KDM4A,KDM4B,KDM4C,KDM5A,KDM5B,KDM5C 和 KDM5D)的 mRNA 表达水平。结果:相较于健康对照组,LADA患者CD4+T淋巴细胞中调控H3K9甲基化水平的组蛋白甲基转移酶SUV39H2的mRNA水平下调,而SET1,SUV39H1和G9a的mRNA水平在LADA患者和健康对照组间比较无统计学差异。相较于健康对照组,LADA患者组蛋白去甲基化酶KDM4C的mRNA水平上调,而LSD1,KDM3A,KDM4A,KDM4B,KDM5A,KDM5B,KDM5C和KDM5D的mRNA水平在LADA患者和健康对照组间比较无统计学差异。相较于LADAnc,LADAc患者亚组CD4+T淋巴细胞SUV39H2的mRNA水平更低(P<0.05),KDM4C的mRNA水平更高(P<0.05),L AD A-1型患者和LAD A-2型患者的组蛋白甲基转移酶SUV39H2及去甲基化酶KDM4C的mRNA水平进行比较,高GADA滴度的LADA-1患者SUV39H2的mRNA水平更低(P<0.05),KDM4C的mRNA水平更高(P<0.05)。结论:LADA患者外周血CD4+T淋巴细胞中组蛋白甲基转移酶SUV39H2表达下调,组蛋白去甲基化酶KDM4C表达上调,这可能是导致LADA患者组蛋白H3K9甲基化水平改变的机制之一。第三部分成人隐匿性自身免疫性糖尿病患者CD4+T淋巴细胞Foxp3、IL-12基因启动子区域组蛋白H3K9甲基化水平目的:研究LADA患者外周血CD4+T淋巴细胞Foxp3、IL-12基因启动子区域组蛋白H3K9甲基化水平。方法:收集3例LADA患者及3例健康对照外周血单个核细胞,分离出CD4+T淋巴细胞,使用染色质免疫沉淀(CHIP)技术结合实时定量PCR方法检测Foxp3、IL-12基因启动子区域的组蛋白H3K9甲基化水平。结果:与健康对照组相比,LADA患者CD4+T淋巴细胞Foxp3基因启动子区域H3K9 甲基化水平无差异,(2.88±0.65)vs(3.25±0.72),P=0.52;LADA 患者 IL-12基因启动子区域H3K9甲基化水平下降,(1.02±0.35)vs(1.88±0.63),P=0.06。结论:LADA患者CD4+T淋巴细胞IL-12基因启动子区域呈H3 K9低甲基化。全文结论:1.LADA患者外周血CD4+T淋巴细胞中H3K9甲基化水平下降,而且H3K9甲基化水平与在LADA发病中起重要作用的GADA滴度呈负相关。2.无糖尿病微血管并发症的LADA患者亚组与伴微血管并发症的LADA患者亚组H3K9甲基化水平存在差异,推测低水平的H3K9甲基化是糖尿病并发症发生发展的危险因素之一。3.LADA患者组蛋白甲基转移酶SUV39H2表达下调,组蛋白去甲基化酶KDM4C表达上调可能是导致其组蛋白H3K9甲基化水平改变的机制之一。4.LADA患者的IL-12基因启动子区域H3K9甲基化水平较健康对照下降,Foxp3基因启动子区域H3K9甲基化水平与健康对照组无显著差异。这丰富了表观遗传学在LADA患者中的研究,为探讨LADA的发病机制提供了新的思路,为LADA的治疗提供了潜在的干预靶点。