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研究背景腹膜透析是终末期肾病(ESRD)终末期肾病患者重要的治疗措施。终末期肾病患者往往伴随着脂代谢的紊乱,约30-70%透析患者的甘油三酯升高,腹透病人较血透患者高胆固醇血症更为突出,通常表现为TC、LDL-C浓度升高,HDL-C降低。腹膜纤维化是腹透患者腹膜失功的重要原因,具体机制仍不清楚,最近研究认为腹膜间皮细胞转分化和细胞外基质(ECM)的蓄积是腹膜纤维化病变最重要的两个病变,葡萄糖、炎症在其中发挥重要作用,但是目前还没有关于脂质在腹膜间皮细胞转分化、及后续的ECM蓄积和纤维化中作用的报告,具体机制也不清楚。研究目的1.观察维持性腹膜透析患者血脂紊乱特点,观察脂代谢紊乱与腹膜转运状态的关系和对间皮细胞功能的影响；2.明确人腹膜间皮细胞(HPMCs)是否能诱导表达LDL受体,并摄取LDL进入细胞内；3.了解LDL对高糖背景下HPMCs转分化的影响；4.了解LDL对高糖背景下HPMCs细胞外基质蓄积的作用；5.探讨PPARγ在LDL诱导HPMCs转分化和ECM蓄积中的作用。材料、方法及结果一、终末期肾病腹膜透析患者脂质代谢紊乱特点选择2009年3月-9月在北京协和医院透析中心规律腹膜透析(超过3月)的患者127例,维持性血透患者95例,对照组为同期门诊和住院的慢性肾脏病(CKD 3-4期)患者130例,随访2年观察患者的死亡情况。收集患者的临床资料、血生化、透析充分性、氮平衡和腹膜转运特点,测定血脂和载脂蛋白全套(TC、TG、LDL-C、HDL-C、Lp(a)、apoA、apoB)、高敏C反应蛋白、腹透液CA125。随诊2年,分析脂质代谢紊乱与腹透患者生存率、腹透液CA125和腹膜转运特点的关系。结果：1.腹透患者脂代谢紊乱比血透患者显著,TC、LDL-C、apoA、apoB均高于血透患者,且白蛋白更低、iPTH降低；2.尽管CA125与TG和TC相关,自身前后对照相关性很好,但是未发现腹膜的转运状态与腹透液CA125相关,也没发现TC、TG和LDL与腹膜转运方式相关。二、LDL对HMCs转分化、ECM蓄积的影响及其机制探讨1.人腹膜间皮细胞株的培养和鉴定外购HMrSV5人腹膜间皮细胞株(HPMCs),采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，常规细胞培养、传代、冻存和复苏。倒置相差显微镜观察细胞形态，细胞未融合前表现为圆形、星形和多边形，细胞融合后呈现铺路石样改变。免疫组化检测细胞抗人角蛋白、抗人波形蛋白细胞浆染色阳性、抗人VIQ因子和CD45抗原染色阴性，符合人腹膜间皮细胞特征。2. HPMCs通过LDL受体摄取LDL进入细胞内免疫荧光观察到LDL可以刺激HPMCs细胞表达LDL受体，主要表达在细胞膜上，少量在胞浆内。油红0染色法观察到HPMCs能摄取LDL进入细胞内，细胞内可见明显的颗粒状红染脂滴，加入LDL受体阻断剂乳铁蛋白能抑制LDL进入细胞内，油红0染色阴性。3. LDL对HPMCs转分化的影响不同浓度的LDL(0、25、50、100μg/ml),刺激HPMCs 24h后在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，发现随LDL浓度增高，细胞间连接逐渐趋于松散，细胞呈现明显梭形成纤维细胞样形态。免疫荧光法观察到对照组胞浆α-SMA阴性，随LDL浓度增加，胞浆内α-SMA荧光强度逐渐增强。HPMCs分为对照组、甘露醇组、葡萄糖30mmol/L组，葡萄糖120mmol/L组(HG组)，HG+LDL组(100μg/ml),RT-PCR(realtime-PCR)和免疫印迹法(Western blot)观察α-SMA和E-cadherin mRNA和蛋白表达。HG+LDL能明显上调α-SMA mRNA和蛋白表达，降低E-cadherin mRNA的表达。4.LDL对HPMCs细胞外基质合成和降解的影响通过RT-PCR法观察以上各组HPMCs胶原(COL-I)和纤维连接蛋白(FN)mRNA表达，ELISA法测定细胞上清中COL-I蛋白含量。HG+LDL能明显上调细胞上清中COL-I蛋白的表达，COL-I和FN在mRNA水平的检测未观察到各组间的显著差异。RT-PCR法检测到HG+LDL比对照组纤溶酶原抑制物(PAI-1)mRNA水平显著增高，ELISA法检测培养细胞上清PAI-1含量，HG+LDL组也显著高于对照组。5.PPARγ在LDL诱导HPMCs转分化和ECM蓄积影响中的作用RT-PCR和Western blot法分别检测不同刺激组PPARγmRNA和蛋白表达情况,HG+LDL能显著上调PPAR y mRNA的表达。在以上研究中,加入不同浓度的GW9662 (5μg/m1、10μg/ml),观察到阻断PPARγ配体能改善HG+LDL对HPMCs形态改变、转分化和ECM降解酶抑制物PAI-1的作用。结论在本实验条件下,我们观察到：1.腹膜透析患者脂代谢紊乱重于血透患者,主要表现为TC、LDL-C和apoB升高；2. HPMCs通过LDL受体摄取LDL进入细胞内；3.LDL能在高糖背景下诱导HPMCs发生转分化、分泌COL-I蛋白增加,并通过上调纤溶酶原抑制物PAI-1 mRNA和蛋白表达,抑制ECM降解,促进ECM蓄积；4.LDL可能通过上调HPMCs细胞PPARγmRNA表达来诱导HPMCs转分化和细胞外基质蓄积。