论文部分内容阅读
心脏是脊椎动物演化过程中的一个重要特征，是胚胎发育中最早建立并行使功能的器官。从低等脊椎动物鱼类到哺乳类，心脏早期形态构建和基因调控网络呈相当的保守性。斑马鱼是脊椎动物发育生物学和遗传学的理想模式，便于进行心脏发育的研究。本研究始于获取大量的转基因斑马鱼，特别是在心脏表达绿色荧光的转基因鱼品系，这些转基因鱼系能够很好的显示心脏发育的形态变化过程，并能模拟内源基因的表达，拟为心脏发育研究搭建一个研究平台。 利用斑马鱼Tol2转座子插入技术，通过大规模筛选绿色荧光(GFP)图谱，共获得了1788个转基因鱼品系。其中18个在心脏中有特异高强度GFP表达。利用LM-PCR的方法对这些品系的鱼进行插入位点定位分析，并结合原位杂交实验进行验证，得到了若干在心脏发育中具有或可能有功能的已知基因或未知基因的转基因鱼品系，为下一步研究心脏发育、基因功能及其调控提供了有用的工具。 以转基因斑马鱼mp170d为例，它的插入点位于nppa的增强子区域附近。实验证明该转基因鱼的GFP表达与内源nppa的表达谱吻合，尽管该插入对心脏的正常功能没有影响，说明Tol2转座子介导的转基因方法确实能“捕获”一些基因的心脏特异增强子，从而为深入研究这些基因在心脏发育中的功能标明了一个方向。转基因斑马鱼mp157e的插入位点则落在一个Rap1 GAP同源基因的倒数第二个外显子中，虽然也没有明显的心脏突变表型。类似其它动物研究的发现，即Rap1在心脏和血管发育中有重要的功能，斑马鱼的实验也表明，通过向受精卵注射反义寡核苷酸链Morpholino，特异敲低rap1a和rap1b的功能，心脏、肌节和尾端发育均呈现发育变异。因此，Tol2转座子介导的随机基因插入可以用于发现y知特异心脏表达基因和不局限于心脏表达的基因，并研究他们在心脏发育中的功能。