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环境中砷污染物的预测和评估是开展砷污染治理、环境保护、人类健康风险评估的重要前提。应用聚合酶链式反应(PCR)从大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a基因组扩增得到砷抗性启动子及其调控蛋白arsR,并首次将一种新型黄色荧光蛋白yfp作为报告基因引入原核细菌构建出砷抗性全细胞传感器DH5a(ars-puc18-yfp),进而对工程菌的特性和表达特点进行研究。最后,对地下水组分于DH5a(ars-puc18-yfp)荧光表达的影响作了初步探索。研究得到了以下几点重要结论:
1.采用As(Ⅲ)和As(V)对工程菌株进行诱导。结果表明,DH5a(ars-puc18-yfp)能够很好的对砷盐应答,表达的黄色荧光呈现时间依赖性和剂量依赖性特点,并且经5h诱导后,工程菌在0-0.8uM的As(Ⅲ)标准溶液中呈线性应答。
2.构建出砷抗性全细胞传感器DH5α(ars-puc18-gfp),并且比较了yfp和gfp这两种报告基因的时间依赖性表达。实验结果显示,yfp除了保留有gfp,原有的优点(热稳定)外,还较好的改进了gfp,信噪比低的缺点。
3.通过比较基于两种不同SD序列(shine-delgarno sequence)的砷抗性全细胞传感器黄色荧光的时间依赖性表达,发现SD序列AAGGAG的应用可明显提高外源蛋白表达的信噪比。
4.分析了地下水样组分对DH5α(ars-puc18-gfp)检测砷的影响。结果表明,磷酸盐及硅酸盐对于工程菌检测砷污染物基本没有影响;而地下中含量较多的铁离子则会造成荧光产量的下降,因此,需要采用合适的络合剂来消除或最大限度的减轻重金属铁离子的干扰。此外,为保护地下水样组分稳定,在取样及保存样品时,应采用HN03调节样本pH至2。