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从多能干细胞诱导分化出可移植、有功能的血液及免疫细胞一直是再生医学领域的研究热点和难点。本文第一部分证明小鼠胚胎干细胞分化来源、体内成熟的T细胞可以结合CAR-T技术改造实现体内清除肿瘤的目的，第二部分初步实现诱导小鼠胚胎干细胞获得可移植的髓系祖细胞种子，移植后可在体内短期再生髓系细胞(包括粒细胞、单核-巨噬细胞)。本研究为再生T细胞以及可移植髓系细胞的转化研究提供了技术借鉴。
嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor Tcells，CAR-T)疗法己成为临床上治疗血液肿瘤的有效手段。通常CAR.T细胞是通过分离患者外周血来源的T细胞在体外进行基因编辑而制备，但是患者自身的T细胞数量有限且经常出现功能异常或耗竭，因此需要探索T细胞新的来源。本研究基于课题组已开发的定向诱导T细胞技术，利用Runxl-Hoxa9条件性表达的多能干细胞系诱导分化出可植入免疫缺陷鼠(B-NDG)的造血祖细胞(induced hematopoietie progenitorcells，iHPCs)，移植B-NDG小鼠5周后，从脾脏中分离出再生的T细胞(induced T cells，iT)，通过将iT细胞感染CD19-CAR逆转录病毒制备CD19-CAR iT细胞。为了验证CD19-CAR iT细胞在体内针对B淋巴瘤细胞的杀伤功能，本研究首先通过移植表达荧光素酶(1uciferase)的B淋巴瘤细胞(Ka539-luciferase)构建了基于C57BL/6的肿瘤负荷鼠模型，随后分别将CD19-CAR iT细胞和Ctrl-CAR iT细胞(阴性对照)过继移植到肿瘤模型中，流式检测发现CD19-CAR iT细胞可以持久抑制外周血中CD19+B细胞的产生，这表明了其具有针对特异抗原的直接杀伤能力。同时小鼠活体成像实验证实CD19-CAR iT细胞可以有效缓解肿瘤模型鼠的肿瘤负荷，并且相比于对照组，经过CD19-CAR iT细胞治疗的肿瘤鼠能够显著延长生存时间(＞70天)。其次，CD19-CARiT细胞在体内接受到CD19抗原刺激后能够快速增殖，并且可被大量激活(CD44+CD62L-)，从侧面印证了CD19-CARiT细胞功能的有效性。以上结果说-明CD19-CAR iT细胞可以有效清除B淋巴瘤细胞，也验证了由多能干细胞诱导再生的iT细胞可以用于制备CAR-T细胞，这为T细胞疗法的新细胞来源提供了技术参考。
与此同时，髓系细胞，特别是粒细胞和单核.巨噬细胞，是天然免疫系统重要成员，在吞噬、杀菌和抗病原体感染中发挥关键作用。因此，再生有功能的髓系细胞对移植和化疗后的抗感染治疗具有重要的临床意义。本研究发现，Runxl-Hoxa10二因子条件性诱导表达的mES细胞系(iR10mESCs细胞系)可诱导分化获得可移植的造血细胞种子，移植后体内再生出髓系细胞，包括粒细胞和单核-巨噬细胞。具体而言，首先通过形成拟胚体(Embryoid bodies，EBs)的方式模拟胚胎发育早期阶段，随后通过诱导Runxl和Hoxa10的表达和添加特定造血细胞因子进行培养获得诱导型生血内皮细胞(iHECs，CD31+CD41lowCD45-c-Kit+CD201hi)。生成的iHECs再和OP9-DL1基质细胞共培养获得诱导型造血祖细胞(induced hematopoietie progenitor cells，iHPCs)，这些iHPCs植入半致死辐照后的Rag1-/-小鼠后成功再生髓系细胞(CD11b+)。PCR测序结果证明体内再生的髓系细胞确实插入了目的基因Runxl和Hoxa10。此外，在骨髓和脾脏组织中均检测到再生的髓系细胞，包括粒细胞(CD11b+Gr1+)、单核细胞(CD11b+Gr1-F4/80-)和巨噬细胞(CD11b+F4/80+)。最后，iHPCs在移植入半致死辐照后的野生型受体鼠后也成功再生髓系细胞。结合再生髓系细胞的功能实验结果，本研究将为再生人髓系细胞提供技术参考，也有望为临床上抗感染细胞疗法等提供新的细胞来源。
嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor Tcells，CAR-T)疗法己成为临床上治疗血液肿瘤的有效手段。通常CAR.T细胞是通过分离患者外周血来源的T细胞在体外进行基因编辑而制备，但是患者自身的T细胞数量有限且经常出现功能异常或耗竭，因此需要探索T细胞新的来源。本研究基于课题组已开发的定向诱导T细胞技术，利用Runxl-Hoxa9条件性表达的多能干细胞系诱导分化出可植入免疫缺陷鼠(B-NDG)的造血祖细胞(induced hematopoietie progenitorcells，iHPCs)，移植B-NDG小鼠5周后，从脾脏中分离出再生的T细胞(induced T cells，iT)，通过将iT细胞感染CD19-CAR逆转录病毒制备CD19-CAR iT细胞。为了验证CD19-CAR iT细胞在体内针对B淋巴瘤细胞的杀伤功能，本研究首先通过移植表达荧光素酶(1uciferase)的B淋巴瘤细胞(Ka539-luciferase)构建了基于C57BL/6的肿瘤负荷鼠模型，随后分别将CD19-CAR iT细胞和Ctrl-CAR iT细胞(阴性对照)过继移植到肿瘤模型中，流式检测发现CD19-CAR iT细胞可以持久抑制外周血中CD19+B细胞的产生，这表明了其具有针对特异抗原的直接杀伤能力。同时小鼠活体成像实验证实CD19-CAR iT细胞可以有效缓解肿瘤模型鼠的肿瘤负荷，并且相比于对照组，经过CD19-CAR iT细胞治疗的肿瘤鼠能够显著延长生存时间(＞70天)。其次，CD19-CARiT细胞在体内接受到CD19抗原刺激后能够快速增殖，并且可被大量激活(CD44+CD62L-)，从侧面印证了CD19-CARiT细胞功能的有效性。以上结果说-明CD19-CAR iT细胞可以有效清除B淋巴瘤细胞，也验证了由多能干细胞诱导再生的iT细胞可以用于制备CAR-T细胞，这为T细胞疗法的新细胞来源提供了技术参考。
与此同时，髓系细胞，特别是粒细胞和单核.巨噬细胞，是天然免疫系统重要成员，在吞噬、杀菌和抗病原体感染中发挥关键作用。因此，再生有功能的髓系细胞对移植和化疗后的抗感染治疗具有重要的临床意义。本研究发现，Runxl-Hoxa10二因子条件性诱导表达的mES细胞系(iR10mESCs细胞系)可诱导分化获得可移植的造血细胞种子，移植后体内再生出髓系细胞，包括粒细胞和单核-巨噬细胞。具体而言，首先通过形成拟胚体(Embryoid bodies，EBs)的方式模拟胚胎发育早期阶段，随后通过诱导Runxl和Hoxa10的表达和添加特定造血细胞因子进行培养获得诱导型生血内皮细胞(iHECs，CD31+CD41lowCD45-c-Kit+CD201hi)。生成的iHECs再和OP9-DL1基质细胞共培养获得诱导型造血祖细胞(induced hematopoietie progenitor cells，iHPCs)，这些iHPCs植入半致死辐照后的Rag1-/-小鼠后成功再生髓系细胞(CD11b+)。PCR测序结果证明体内再生的髓系细胞确实插入了目的基因Runxl和Hoxa10。此外，在骨髓和脾脏组织中均检测到再生的髓系细胞，包括粒细胞(CD11b+Gr1+)、单核细胞(CD11b+Gr1-F4/80-)和巨噬细胞(CD11b+F4/80+)。最后，iHPCs在移植入半致死辐照后的野生型受体鼠后也成功再生髓系细胞。结合再生髓系细胞的功能实验结果，本研究将为再生人髓系细胞提供技术参考，也有望为临床上抗感染细胞疗法等提供新的细胞来源。