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肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是肝脏对各种慢性刺激进行损伤修复反应时,以胶原为主的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝内大量沉积的病理过程。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)在肝纤维化形成过程中居核心地位,激活的HSC是产生ECM的主要来源。 瞬时受体电位通道7(transient receptor potential melastatin7,TRPM7)是具有非选择性阳离子通道和蛋白激酶双重结构的双功能膜蛋白。作为离子通道蛋白,其对包括Ca2+、Mg2+、K+、Na+在内的多种二价和单价阳离子具有通透性,而作为一种蛋白激酶,其可使自身或底物磷酸化。TRPM7分布广泛,组成性表达于哺乳动物的心、肝、肾、肺、脑等多种器官和组织中,通过影响[Ca2+]i的变化及细胞内信号转导通路,参与细胞的多种生理和病理过程。 我们在前期研究中发现,PDGF-BB(20 ng/ml)刺激大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)12 h后,TRPM7 mRNA和蛋白水平均显著提高(P<0.01)。运用非特异性阻断剂2-氨基乙基联苯基硼酸酯(2-aminoethoxydiphenyl borate,2-APB)或Gd3+阻断TRPM7通道,可显著提高HSC-T6对肿瘤坏死因子凋亡相关配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)敏感性,增加细胞凋亡。提示TRPM7参与HSC凋亡过程,且阻断TRPM7可促进HSC凋亡。 鉴于TRPM7具有促进细胞增殖的功能,以及HSC活化增殖是肝纤维化发生发展的主要细胞生物学基础,我们提出疑问,TRPM7是否参与活化HSC的增殖?TRPM7对活化的HSC胶原产生和降解是否有影响?TRPM7在纤维化肝组织中是否有异常表达?因此,本研究首先搜集人肝纤维化标本和采用经典的CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型,观察 TRPM7表达在体内是否有变化;然后选用 HSC-T6细胞株,研究 TRPM7对血小板衍生长因子B(platelet derived growth factor B,PDGF-BB)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导的HSC活化、增殖以及胶原生成和降解的影响;最后观察 TRPM7是否影响PI3K/AKT、ERK以及 TGF-β/Smads通路蛋白表达,进一步明确 TRPM7调控HSC-T6增殖和胶原合成与降解的分子机制。 研究内容主要包括以下六个部分: 1.TRPM7在纤维化肝组织以及活化HSC中表达增加 我们首先检测人肝纤维化以及 CCl4诱导大鼠肝纤维化模型的肝组织中TRPM7的表达。RT-PCR、免疫组化以及Western blot检测结果显示:肝纤维化组TRPM7 mRNA和蛋白水平显著高于正常组。原位灌流提取大鼠正常和纤维化肝组织中HSC,Real Time PCR结果显示:模型组HSC中TRPM7 mRNA水平显著升高。体内试验结果表明纤维化肝组织和活化HSC中TRPM7表达显著增加。 PDGF-BB和TGF-β1被认为是强促HSC增殖和胶原合成的因子,也是重要的促纤维化因子。因此,体外试验选用PDGF-BB和TGF-β1分别刺激HSC-T6细胞株,以阐明TRPM7在HSC活化、增殖、胶原合成和降解过程中的作用。PDGF-BB(10 ng/ml)和TGF-β1(5 ng/ml)体外刺激HSC-T6,TRPM7 mRNA和蛋白表达水平呈时间依赖性地显著增加。与此同时,HSC活化指标α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscleα-actin,α-SMA)和I型胶原α1(collagen type1 alpha1,Col1α1)mRNA和蛋白亦随PDGF-BB和TGF-β1刺激时间延长而显著增加。 2.阻断TRPM7通路,抑制PDGF-BB和TGF-β1诱导的HSC的活化 运用离子通道抑制剂2-APB或 siRNA阻断 TRPM7通道,可显著抑制由PDGF-BB和TGF-β1诱导的α-SMA和Col1α1表达。提示TRPM7通道在HSC活化和胶原合成过程中可能发挥了重要的调控作用。 3.阻断TRPM7通路,纠正MMP-2/TIMP-2、MMP-13/TIMP-1比例,调节TGF-β1刺激的HSC中胶原的降解 肝纤维化过程中,ECM合成和降解失衡,从而导致其过度沉积。纤维化肝组织和TGF-β1刺激活化的HSC-T6中,MMP-2和其抑制因子TIMP-1、TIMP-2表达显著增加。2-APB或 siRNA阻断 TRPM7通道,显著提高活化的HSC-T6中MMP-13 mRNA和蛋白水平,降低TIMP-1、TIMP-2的表达,但对MMP-2的表达无显著影响。表明阻断TRPM7通道,可提高MMP-2/TIMP-2、MMP-13/TIMP-1比值,纠正MMPs/TIMPs比例,促进ECM降解。 4.阻断TRPM7通路,降低细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase4,CDK4)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达,抑制PDGF-BB诱导的HSC增殖 不同浓度(3、10、30、100、300μM)2-APB与PDGF-BB(10 ng/ml)共培养HSC-T6,MTT结果显示:2-APB可抑制HSC-T6活力,且抑制活性呈浓度依赖性。运用siRNA沉默HSC-T6中TRPM7,MTT结果显示:HSC-T6活力显著下降。提示阻断TRPM7通道,可显著抑制活化的HSC活力。进一步研究发现,2-APB或siRNA阻断TRPM7通道,可显著降低细胞周期蛋白Cyclin D1、CDK4和PCNA蛋白表达。表明阻断TRPM7通道,减少Cyclin D1、CDK4和PCNA表达,影响HSC细胞周期,从而抑制细胞增殖。 5.TRPM7通过PI3K/AKT、ERK通路调控PDGF-BB诱导的HSC增殖 PI3K/AKT和ERK信号通路在肝纤维化过程中发挥了重要的调节作用。Western blot结果显示大鼠纤维化肝组织和PDGF-BB刺激的HSC-T6中,p-AKT和p-ERK蛋白水平显著增加。2-APB或siRNA阻断TRPM7通道,可显著抑制HSC-T6中AKT、P70S6K和ERK的磷酸化水平。表明阻断TRPM7通道,抑制HSC中PI3K/AKT和ERK通路,从而抑制细胞增殖。 6.TRPM7通过TGF-β1/Smads通路调控TGF-β1刺激的HSC中胶原合成和降解 大鼠纤维化肝组织和TGF-β1刺激 HSC-T6中,p-Smad2、p-Smad3、Smad4蛋白水平均显著升高。siRNA沉默TRPM7,可显著降低p-Smad2、p-Smad3表达,而对Smad4蛋白水平无显著影响,表明阻断TRPM7通道,可减少活化HSC中p-Smad2和p-Smad3表达,从而抑制TGF-β1/Smads信号通路,进一步调控HSC活化与胶原产生。