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一、背景肝癌在我国仍居于癌症死因的第二位。目前肝癌的主要治疗方法以外科治疗为主,但术后复发率5年内仍高达80%左右。侵袭转移是目前影响肝癌术后复发的主要因素,但其机制较复杂,目前仍未完全阐明。近年来越来越多的研究证据表明,神经调控在癌症的发生发展过程中起着重要的作用。肝脏受交感和副交感神经的支配,其中迷走神经释放的乙酰胆碱等神经递质通过特异性结合相应的受体使其活化,进而发挥多种生物效应。本课题组前期的研究已经证明迷走神经兴奋可以促进肝癌的侵袭转移,且肝癌细胞中表达多种胆碱能受体。已有报道表明胆碱能受体M1的活化(ChRM1)与肺癌、前列腺癌的侵袭转移相关。因此,研究胆碱能受体M1活化对肝癌侵袭转移的作用机制将为防治肝癌的复发转移提供新的理论基础。二、目的研究胆碱能受体M1在肝癌中的表达情况,以及该受体活化后对肝癌侵袭转移的影响,并初步探讨M1受体活化调控肝癌侵袭转移的分子机制。三、方法1.收集临床肝癌病例标本63例,采用免疫组织化学技术,检测ChRM1在肝癌病人的表达情况,并分析ChRM1的表达与肝癌病人临床病理特征的关系。2.离体培养人肝癌细胞株Hep G2和SMMC-7721,采用Western Blot技术验证肝癌细胞中ChRM1的表达。分别使用ChRM1激动剂和阻滞剂作用于两种肝癌细胞,用Transwell侵袭迁移实验检测激动或阻滞ChRM1后肝癌细胞迁移和侵袭能力的变化。构建干扰质粒,抑制两种肝癌细胞中ChRM1的表达,然后采用特异性激动剂处理肝癌细胞,用Transwell实验检测抑制ChRM1表达后,肝癌细胞迁移和侵袭能力的变化。3.干扰质粒处理癌细胞株Hep G2以抑制ChRM1(sh ChRM1)的表达,经流式细胞仪分选筛选出相对稳定表达ChRM1敲除的细胞株。将正常肝癌细胞和筛选后的肝癌细胞分别经腹腔注射入裸鼠肝脏,每种处理组的老鼠又分为饮用水含氯贝胆碱组和不含氯贝胆碱组,一共分为四组(Control组:正常Hep G2细胞并喂以正常水;Be Ch组:正常Hep G2细胞并喂以含有BeCh(400ug/ml)的水;Be Ch+M1 shRNA组:干扰后的Hep G2细胞并喂以加有BeCh(400ug/ml)的水;M1 shRNA组:干扰ChRM1后的HepG2细胞并喂以正常水)。观察培养两月左右,30天时经小动物磁共振成像技术观察统计各组小鼠肝内病灶以及转移情况。4.分别使用激动剂和阻滞剂处理肝癌细胞和干扰质粒抑制两种肝癌细胞中ChRM1受体的表达。采用Western Blot实验检测ChRM1被激动或抑制后,两种肝癌细胞中上皮-间质转化(EMT)相关标志物的表达变化。5.激动剂和阻滞剂分别作用于两种肝癌细胞和激动剂处理ChRM1沉默后的两种肝癌细胞,提取总蛋白。Western Blot实验检测激动或阻滞ChRM1后,相关信号通路的变化情况。四、结果1.ChRM1在肝癌组织中高表达,且ChRM1表达与肝癌病人的肝癌复发、血管侵犯、分化程度和TNM分期具有正相关性,ChRM1表达越高的肝癌病人生存时间越短。2.肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721中均表达ChRM1。ChRM1的激活能够促进肝癌细胞的侵袭迁移,而应用特异性阻滞剂阻断ChRM1和干扰ChRM1的表达都能够抑制肝癌细胞的侵袭转移。3.动物肝脏移植瘤模型显示,BeCh组的裸鼠肝内转移病灶最多,并且生存时间短。而Be Ch+M1 shRNA组和M1 shRNA组的裸鼠中肝内转移病灶数量最少,且生存时间长。4.肝癌细胞ChRM1的活化能够上调N-Cadherin和下调E-Cadherin的表达,促进EMT的发生,而阻断和干扰ChRM1的表达能够抑制肝癌细胞EMT的过程。5.ChRM1的活化能够促进Akt的磷酸化和Slug的表达。而阻断和干扰ChRM1的表达能够抑制Akt的磷酸化和Slug的表达。五、结论1.ChRM1的表达越高表明肝癌的恶性程度越高和预后越差。2.ChRM1的活化能够通过激活PI3K/Akt信号通路促进肝癌细胞EMT的发生,进而促进肿瘤的侵袭转移。