论文部分内容阅读
本研究主要内容包括：黄曲霉毒素B1（AFB1）人工抗原的制备，AFB1间接竞争ELISA检测方法的建立，以及AFB1单克隆抗体免疫亲和柱的研制。
在AFB1人工抗原制备的第一步肟化反应中，用室温肟化法代替传统的加热回流法，使肟化率达到95％；在第二步EDC法制备AFB1肟化物与载体蛋白的偶联物时，采用修饰的牛血清白蛋白(M-BSA)，避免了EDC引起的蛋白质自身交联问题。并在制备过程中通过TLC与ELISA方法对反应进行监控，确定了最佳的肟化反应时间与偶联反应时间，并就AFB1与M-BSA的起始摩尔比对偶联产物中两物质摩尔比的影响进行了实验。结果确定了25℃肟化反应24h，偶联反应24h，AFB1与M-BSA的起始摩尔比30：1的反应条件，得到偶联比为5：1的AFB1人工抗原。
在AFB1间接竞争ELISA检测方法的建立过程中，对包被条件、封闭条件、抗原抗体浓度、甲醇含量以及竞争反应模式等因素进行了优化，确定了以下实验条件：包被抗原浓度2.5μg/mL、37℃包被4h；5％脱脂奶37℃封闭2h；竞争反应中抗体稀释倍数1：4000，甲醇含量10％，37℃于板外预先作用1h，再转入板内竞争反应1h。该方法对AFB1检测的线性范围为0.15ng/mL-10ng/mL，灵敏度为1.5ng/mL，最低检测限为0.1ng/mL。
在AFB1单克隆抗体免疫亲和柱的制备研究中优化了免疫亲和柱的制备条件与使用条件。在制备过程中，当抗体浓度不低于1mg/mL、25℃偶联3h时，单克隆抗体与活化载体的偶联率大于90％。在使用过程中，以甲醇-PB(20：80，v/v，pH7.0，含0.2％NaCl)作为上样Buffer，以10mL/min的流速上样；经20mL20％甲醇水溶液洗涤后，用1mL甲醇洗脱4min，经碘柱后衍生-HPLC检测，得到的AFB1标准品回收率大于85％。