哮喘大鼠针刺后响应基因的克隆及其蛋白表达与纯化

• 作 者: 王燕
• 机 构: 上海中医药大学
• 出 处: 上海中医药大学
• 发表日期: 2006年期
• 关键词: 针刺疗法 肺组织 哮喘 基因克隆

目的：基于SAGE技术分析结果，研究针刺哮喘大鼠肺组织差异表达基因，为阐明针灸效应的现代生物学机理奠定工作基础。
方法：在针刺治疗哮喘有效性的基础上，运用RACE、RT-PCR、基因克隆、重组表达、蛋白纯化技术，研究针刺治疗大鼠哮喘的响应基因及转录蛋白。
结果：
1.哮喘大鼠针刺后响应基因标签的扩增与验证结果
1)用RACE扩增了10个基因标签，扩增结果与SAGE匹配结果一致，验证了SAGE在分析基因表达方面的准确性及灵敏性。
2)RT-PCR获得6个基因片段产物，从中随机抽取MGP、DBI、HSP8三个进行RT-PCR验证，结果三个基因在三组间的表达存在显著差异，MGP、DBI与SAGE分析结果一致，HSP8在三组间的差异与SAGE结果存在不同。
2.基因克隆、重组质粒构建结果
1)抽提了pMD19T-MGP、pMD19T-DBI、pMD19T-CYRL、pMD19T-S100A9、pMD19T-RAB7、pMD19T-HSP8六个基因质粒，经酶切、测序鉴定，显示基因片段已正确连接入pMD19T克隆载体。
2)构建了pET22b(+)-MGP、pET22b(+)-DBI、pET22b(+)-CYRL、pET22b(+)-S100A9四个重组质粒，测序表明其中pET22b(+)-MGP、pET22b(+)-CYRL、pET22b(+)-S100A9三个基因与表达载体连接正确，重组质粒构建成功。3.S100A9、CYRL基因的重组蛋白表达与纯化
1)S100A9表达蛋白的分子量(约13.0kDa)与理论分子量(13.1kDa)相符，诱导表达结果显示此蛋白以可溶性形式存在于菌体上清中。
2)CYRL表达蛋白的分子量(约32.0kDa)比理论分子量(28.1kDa)大，诱导表达结果显示此蛋白在菌体沉淀中存在。
结论：经RACE扩增、RT-PCR验证、基因克隆与重组和蛋白质表达与纯化，本研究获得了2个针刺治疗大鼠哮喘响应基因的表达产物。为从功能基因组研究针灸效应物质基础提供了实验研究依据，为阐明针灸治疗疾病的现代生物学机理提供了新的研究思路。