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支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）指新生儿尤其是早产儿因各种病因接受氧气或机械通气治疗，终致氧气依赖超过28d者。随着新生儿重症监护的发展，呼吸衰竭新生儿救治率不断提高，与氧疗相关的BPD发病率也相应增加，并成为婴儿期最常见的慢性呼吸系统疾病。由于目前尚无有效的预防措施及治疗方法，BPD已成为新生儿专业亟待解决的课题。为探讨BPD可能的治疗手段，本研究选用3日龄新生小鼠，60%氧浓度下暴露21天建立BPD小鼠模型，通过将体外分离培养骨髓间充质干细胞，移植入模型鼠体内，本实验运用细胞培养、特殊染色病理技术、电子显微镜技术、激光共聚焦技术、流式细胞术、Western Blotting、荧光原位杂交、免疫荧光、实时荧光定量PCR等多种实验方法，证明外源性干细胞可在受损肺组织定植并分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞，促进肺组织修复。
本研究共分为四部分：
第一章、小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定。
目的：探讨小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）进行分离、纯化及鉴定的方法。
方法：取3-4周龄雄性昆明小鼠，无菌条件下分离股骨及胫骨骨髓，采用密度梯度离心法结合贴壁细胞分离法培养MSCs，观察不同代细胞的形态；流式细胞术检测细胞表面标志物CD44、CD106、CD34、CD117的表达情况；并进行成骨、成脂诱导培养确定干细胞的多向分化潜能。
结果：原代培养接种48h后可见细胞贴壁生长，72h细胞大部分贴壁，4-5d开始形成集落方式生长，10-14d后，细胞密度进一步增加，基本铺满瓶底。原代培养的MSCs大部分呈梭形或纺锤形，细胞体积大，呈放射状分布，传代培养后的细胞生长明显加快，且不再以集落方式生长，而呈均匀性分布生长；细胞表面标志物检测显示CD44 （93.69%）、CD106阳性（98.16%），CD34、CD117阴性，并具有成骨、成脂分化潜能。
结论：密度梯度离心法结合贴壁细胞分离法可成功分离纯化小鼠MSCs。
第二章、支气管肺发育不良小鼠模型的建立。
目的：建立支气管肺发育不良小鼠模型。
方法：将30只3日龄昆明小鼠随机分为2组，每组15只。氧气组：15只新生鼠置于封闭氧箱中，持续输入氧气，测氧仪监测维持FiO2为0.60，CO2浓度<0.5%（用碱石灰吸收CO2），温度23℃～26℃，湿度50.0%～60.0%，每日09：00开箱1h，添加水、饲料、更换垫料。空气对照组：FiO2为0.21（空气），具体方法及控制因素同氧气组。分别于实验7d、14d、21d，每组随机选取5只小鼠，称重后处死，分离肺组织待检测。
结果：动物一般状态：氧气组小鼠7d时毛发无光泽，脱氧时呼吸稍急促，恢复供氧可迅速缓解；14d时精神萎靡，脱氧时烦躁不安，呼吸困难明显，鼻尖稍发绀，恢复供氧可逐渐缓解；21d时反应差，氧浓度降低时呼吸困难加重，呼吸动度增大，并可闻及明显喉鸣，可见头颤，鼻尖及舌尖发绀，提高氧浓度逐渐缓解。实验动物体重：各时间点对应的氧气组小鼠体重均较空气组降低，其差别具有统计学意义（P均<0.001）。肺组织病理学改变：空气组实验7d肺组织结构逐渐规整，肺泡大小较均匀，肺泡间隔较厚；7d 以后至21d，肺泡结构规整，肺泡大小均一，肺泡间隔薄。氧气组给氧7d，肺泡腔增大，肺泡壁薄，肺间质细胞增加；给氧14d，肺泡腔明显增大，部分肺泡融合、肺泡数量减少，肺间质细胞增生；给氧21d时肺泡正常结构消失，肺泡腔直径明显扩大，肺泡数量明显减少，大面积肺泡融合，肺泡间隔增厚，大量间质细胞增生。RAC计数：各时间点对应的氧气组小鼠RAC均较空气组降低，其差别具有统计学意义（P均<0.001）。肺组织超微结构：空气组肺泡上皮细胞结构完整，Ⅱ型细胞板层小体及微绒毛清晰；氧气组7d时板层小体开始排空，微绒毛减少，线粒体肿胀；14d时线粒体嵴断裂，板层小体基本排空；21d时板层小体明显减少甚至消失，微绒毛明显减少，部分细胞核固缩、溶解。肺Ⅰ型、Ⅲ型胶原天狼猩红染色：偏振光显微镜下，0.1%苦味酸天狼猩红特殊染色可见肺组织内Ⅰ型胶原呈现黄色及红色、紧密排列，Ⅲ型胶原则呈现纤细的绿色、疏网状排列。在空气组肺组织，Ⅰ型、Ⅲ型胶原主要分布在气道壁及血管壁，氧气组则明显增多，分布广泛，并可见局部聚集现象。图像分析结果：各时间点内，氧气组动物Ⅰ型、Ⅲ型胶原面积均高于对照组、差异均有显著意义（P值均<0.001）。Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白含量：各时间点，氧气组动物Ⅰ型、Ⅲ型胶原面积均高于对照组、差异均有显著意义（P值均<0.001）。
结论：3日龄新生小鼠于60%氧浓度暴露21d成功建立支气管肺发育不良小鼠模型。模型鼠体重降低，脱氧则呼吸困难明显，肺组织受损改变主要表现为肺泡发育阻滞及肺纤维化。
第三章、骨髓间充质干细胞在支气管发育不良小鼠肺组织内的植入及分化。
目的：观察小鼠骨髓间充质干细胞在支气管发育不良小鼠肺组织内的定植及分化。
方法：雄性昆明小鼠MSCs分离培养同第一部分，移植前采用DAPI标记细胞核以体内示踪。BPD小鼠模型建立同第二章。将60只雌性昆明小鼠分为4组，每组15只：（1）BPD+MSCs组：参照第二章方法建立的BPD模型，经颈外静脉注射DAPI标记的MSCs 3×106/只（0.3mL）；（2）BPD+DMEM组：参照第二章方法建立的BPD模型，经颈外静脉注射等量DMEM培养基液（0.3mL）；（3）正常+MSCs组：健康24日龄雌性小鼠，经颈外静脉注射DAPI标记的MSCs 3×106/只（0.3mL）；（4）正常+DMEM组：健康24日龄雌性小鼠，经颈外静脉注射等量DMEM培养基液（0.3mL）。于移植后3d、7d、14d每组随机选取5只小鼠，采用Y染色体荧光原位杂交及免疫荧光共同检测外源性MSCs的表达，并采用荧光实时定量PCR检测雄性供体细胞SRY基因及受体肺上皮细胞SP-C、AQP5基因表达量。
结果：荧光原位杂交及免疫荧光共表达：各组于移植后3天均未检测到外源性细胞表达；移植后7天BPD+MSCs组检测到Y染色体及DAPI阳性细胞表达肺泡Ⅱ型上皮细胞标志物SP-C，提示供体MSCs分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞，其余3组始终未见外源性细胞表达SP-C；至移植后14天，均未检测到外源性细胞表达Ⅰ型细胞标志物AQP5。各基因mRNA含量测定：BPD+MSCs组SRY mRNA随移植时间延长逐渐增加（P<0.001），其余3组3个时间点均未检测到SRY表达；BPD两组SP-C mRNA随移植时间延长均逐渐增加（P<0.001），其中BPD+MSCs组各时点mRNA均高于BPD+DMEM组（P<0.001），空气+MSCs及空气+DMEM两组含量无区别（P>0.05）；四组AQP5mRNA含量均无差别（P>0.05）。mRNA检测结果间接证明，供体MSCs移植后可于BPD小鼠损伤肺组织中定植并分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞；外源性干细胞在正常肺组织没有定植。
结论：骨髓间充质干细胞可在支气管发育不良小鼠受损肺组织中存活，并可分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞；在观察期内，尚未发现肺泡Ⅰ型细胞的转化证据。骨髓间充质干细胞在正常小鼠肺组织中未发现定植。
第四章、骨髓间充质干细胞对支气管肺发育不良小鼠生物学作用的体内研究。
目的：观察外源性骨髓间充质干细胞移植对支气管肺发育不良小鼠肺损伤的修复作用。
方法：雄性昆明小鼠MSCs分离培养、体外标记及动物分组同前。于移植后3d、7d、14d每组随机选取5只小鼠，分离肺组织待检。
结果：移植后各组小鼠肺组织形态学比较：空气组表现同第二章，BPD两组于3d时无明显区别，移植后7d、14d，BPD+MSCs组较BPD+DMEM组肺泡破坏程度均有减轻。移植后各组小鼠肺Ⅰ型、Ⅲ型胶原比较：空气+MSCs及空气+DMEM两组胶原变化无差别；BPD两组Ⅰ型、Ⅲ型胶原面积及胶原mRNA含量比较显示，各时点BPD+MSCs组胶原面积均较BPD+DMEM组降低（P<0.05），两组面积均呈减少趋势，BPD+MSCs组胶原mRNA均较BPD+DMEM组降低（P<0.01），两组mRNA均呈减少趋势。
结论：骨髓间充质干细胞对支气管发育不良小鼠肺部损伤有一定修复作用，表现为组织形态学改善、肺组织纤维化减轻。