论文部分内容阅读
白粉病是危害小麦生产的主要病害之一,而抗性品种培育和应用是预防白粉病危害最经济和安全的途径。迄今,在小麦及其近缘种属中已发现50余个抗白粉病基因,并且大多数都已经进行了定位和分子标记。白粉病菌菌系多,变异快。随着新的白粉病菌系的不断产生,多数Pm基因陆续“丧失”抗性。目前,只有来自小麦属的Pm4、Pm16和Pm30,以及来自小麦近缘属的Pm20和Pm21等少数几个Pm基因对我国流行的白粉病优势菌系具有有效抗性。因此,发掘和利用新的抗性白粉病基因对于小麦抗病育种和生产发展具有重要意义。
黑麦6R染色体的长臂上有一个抗白粉病基因Pm20。抗性鉴定证明,Pm20基因对我国绝大多数白粉病菌系表现良好抗性,具有重要的抗病育种应用价值。本文对黑麦6RL上的编码NBS-LRR类蛋白的抗白粉病基因进行了克隆和功能研究。
根据植物R基因的NBS结构域保守序列设计引物,通过PCR扩增和RACE方法,从含有Pm20基因的小麦/黑麦6RL/6BS易位系TAM104R中克隆了一个定位于6RL的NBS-LRR类基因RGA-rye。序列分析表明,RGA-rye基因的编码区没有内含子,ORF全长3810bp,编码1269个氨基酸,分子量约为143.6kDa。表达谱分析表明RGA-rye在叶片中表达活性最高,而在根中表达最低。洋葱表皮细胞瞬时表达实验显示,RGA-rye基因的表达产物在细胞质和细胞核中都有分布。通过VIGS降低RGA-rye表达后,TAM104R对白粉病菌系E18的抗性反应型由免疫(0-0；级)转变为感病(3-4级)。细胞瞬时表达实验表明,在感病小麦品种Chancellor叶片细胞中瞬时过表达RGA-rye基因显著抑制了白粉病菌吸器的形成,吸器指数由58.95％下降到37.80％,达到极显著水平。以上结果证明RGA-rye基因在小麦抗白粉病反应过程中发挥了重要作用。
利用RGA-rye基因特异引物筛选黑麦的BAC文库,获得了4个阳性克隆。酶切和端部序列分析表明,这4个阳性克隆构成一个重叠群。其中的BAC956-D7基本覆盖了其它3个克隆。因此对BAC956-D7进行了全长测序。序列分析发现,BAC956-D7至少含有22个ORF,其中包括3个NBS-LRR类基因,分别命名为ScRGA-8、ScRGA-27和ScRGA-30。BAC956-D7结构分析表明,ScRGA-27和ScRGA-30基因位于BAC956-D7的一端,两者相隔约7kb,而ScRGA-8基因位于BAC956-D7的中部,与ScRGA-27相隔约50kb。基因序列分析显示,ScRGA-8的基因组DNA序列全长9227bp,有2个内含子,cDNA全长3435bp,编码1144氨基酸。ScRGA-27基因组序列长3810bp,编码区没有内含子,编码1269个氨基酸,且与RGA-rye编码的氨基酸序列完全一致,说明两者是同一个基因。ScRGA-30基因组序列长4232bp,有一个内含子,cDNA全长3813bp,编码1270个氨基酸。进一步从TAMl04R中克隆了以上3个ScRGA基因,序列比较分析显示,来自TAM104R的3个ScRGA基因序列与BAC956-D7中的这3个基因的序列长度一致,同源性均在98％以上。
表达谱分析表明,ScRGA-8和ScRGA-30基因与ScRGA-27(ScRGA-rye)相似,也是在叶片中表达活性最高,在根中表达最低。洋葱表皮细胞瞬时表达实验显示,这两个基因的编码蛋白也都定位于细胞质和细胞核中。
利用VIGS系统和细胞瞬时表达实验对ScRGA-8和ScRGA-30基因的抗白粉病功能进行了验证。在VIGS实验中,当ScRGA-8和ScRGA-30表达量降低后,TAM104R对白粉病菌系E18的抗性丧失,反应型由0-0；级变为3-4级。在单细胞瞬时表达实验中,在感病品种Chancellor叶片细胞中过表达ScRGA-8和ScRGA-30基因,吸器指数由58.95％分别下降到35.2％和42.07％,在不含有Pm20基因的小麦/黑麦6RL/6BS易位系TAM104S中过表达ScRGA-8、ScRGA-27和ScRGA-30基因,吸器指数由30.31％分别下降到19.96％、19.52％和18.06％。由此证明,这3个RGA基因均具有抗小麦白粉病功能。
进一步从TAM104S中克隆了ScRGA-8、ScRGA-27和ScRGA-30的同源基因。序列比对发现,TAM104S中ScRGA-8和ScRGA-30的同源基因具有完整的ORF,与TAM104R中ScRGA-8和ScRGA-30的相似性分别为97.6％和96.4％。而ScRGA-27的同源序列有2bp缺失,从而造成在编码区出现提前终止子而不能通读。由此推测,ScRGA-27基因可能是致使TAM104R和TAM104S抗白粉病差异的一个主要基因。