【摘 要】
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目的以牛乳铁蛋白为抗原,通过动物免疫、间接ELISA方法建立、细胞融合、阳性克隆筛选、亚克隆等步骤,获得能分泌抗体的单克隆细胞株,并制备、纯化腹水,进行效价和特异性鉴定,
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目的以牛乳铁蛋白为抗原,通过动物免疫、间接ELISA方法建立、细胞融合、阳性克隆筛选、亚克隆等步骤,获得能分泌抗体的单克隆细胞株,并制备、纯化腹水,进行效价和特异性鉴定,以获得效价高、特异性强的单克隆细胞株,为下一步研制BLF检测试剂盒奠定基础。方法结合国内外文献报道,依据本实验室的具体情况,将一定量牛乳铁蛋白与弗氏佐剂混合充分乳化,免疫BALB/c小鼠,100μg/只,共免疫4次(间隔2周);采血测定血清抗体效价并建立间接ELISA方法,待血清效价大于1:3000时进行细胞融合。取血清效价高的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG1500的作用下进行细胞融合;使用已建立的间接ELISA方法进行筛选,阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆;得到的单克隆细胞株进行扩大冻存及腹水制备。腹水进行效价测定;使用试剂盒测定其抗体亚型,进行抗体纯化、纯度及特异性检测。结果4次免疫后小鼠抗体效价达到1:6400以上。以PEG1500进行细胞融合,融合孔为296孔,融合率达到77.08%。经间接ELISA筛选,共得14个阳性孔,阳性率为3.65%。两次亚克隆后得到两株单克隆细胞株:3C9、4E11。经腹水制备、效价检测等试验,最终确定两者抗体亚型均为IgG2b、κ型,SDS-PAGE检测纯度较高。将纯化单抗与牛乳中酪蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白和血清白蛋白进行交叉反应性实验结果均呈阴性,表明两株细胞分泌的单抗特异性较好。结论以牛乳铁蛋白为抗原,通过动物免疫、细胞融合、间接ELISA筛选、亚克隆获得两株能分泌抗体的单克隆细胞株,所得单抗特异性较好。
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