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乳腺癌是全球女性发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,严重威胁着女性的健康与生命。恶性增殖和转移侵袭是导致乳腺癌患者不良预后及致死的主要原因。研究揭示乳腺癌增殖和转移机制,将为发现乳腺癌诊疗的新靶点分子、应用生物技术发展创新药物及治疗新方法新策略,提供重要的实验基础。乳腺癌等恶性肿瘤的发生发展与蛋白质的O-GalNAc糖基化修饰异常密切相关。多肽-N-乙酰半乳糖胺转移酶（polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferases,ppGalNAc-Ts,简称 Ts）催化 O-GalNAc 型糖基化修饰的起始步骤,迄今已发现至少20种ppGalNAc-Ts同工酶,它们特异的底物蛋白及功能仍待阐明,也是糖生物学研究的热点和难点之一。研究发现,ppGalNAc-Ts家族成员ppGalNAc-T4在多种上皮样肿瘤中发挥抑癌作用,但其特异性修饰的底物蛋白及O-GalNAc糖基化位点鲜有报道,且ppGalNAc-T4在乳腺癌发生发展进程中的功能及作用机制尚不明确。本论文旨在阐明ppGalNAc-T4在乳腺癌增殖和转移中的作用及机制,发现并确认其修饰的底物蛋白,以探索ppGalNAc-T4在乳腺癌诊断及治疗中的潜在应用价值,本论文的主要工作如下:（1）ppGalNAc-T4对人乳腺癌细胞增殖的抑制作用及其分子机制。基于TCGA、GEO数据库中人乳腺癌基因表达分析发现,ppGalNAc-T4在人乳腺癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常乳腺组织,其高水平表达与乳腺癌患者预后无复发生存率呈现正相关关系;在增殖能力较高的MDA-MB-231细胞中上调ppGalNAc-T4表达,在增殖能力较低的MCF7细胞中敲除ppGalNAc-T4表达,利用MTT、细胞克隆形成实验发现,ppGalNAc-T4抑制细胞增殖;通过对转录组测序中差异表达基因功能聚类分析、基因集富集分析以及使用流式细胞术、免疫印迹等实验发现并验证,ppGalNAc-T4通过抑制Notch信号途径活性,调控细胞周期相关蛋白如Cyclin D1、p27等的表达,从而减缓细胞周期进程,抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF7的增殖能力。（2）ppGalNAc-T4对人乳腺癌细胞转移潜能的抑制作用及其分子机制。在MDA-MB-231细胞中上调ppGalNAc-T4表达、在MCF7细胞中敲除ppGalNAc-T4表达,通过细胞结晶紫染色实验观察到,ppGalNAc-T4表达促进人乳腺癌细胞形态发生上皮样转变;通过细胞划痕及Transwell细胞小室实验证明,ppGalNAc-T4抑制人乳腺癌细胞转移潜能;通过实时定量PCR、免疫印迹、细胞免疫荧光化学等实验证明,ppGalNAc-T4通过抑制转化生长因子-β（TGF-β）信号途径,进而阻碍人乳腺癌细胞上皮-间质转化（EMT）过程发生。（3）发现并确证TGF-βⅡ型受体（TβRⅡ）为ppGalNAc-T4的新底物。首先,在人胚肾HEK-293T细胞系中分别共转染ppGalNAc-T4与两种TGF-β受体表达质粒后,免疫共沉淀结合免疫印迹分析结果显示,外源性ppGalNAc-T4与TGF-β Ⅰ型受体（TβRⅠ）及TβRⅡ之间存在相互作用,提示TβRⅠ及TβRⅡ可能是ppGalNAc-T4的底物;其次,免疫共沉淀结合识别O-GalNAc糖基化的凝集素VVL印迹分析发现,在分别转染TβRⅠ和TβRⅡ全长或胞外段表达质粒的MCF7、HEK-293T细胞中,ppGalNAc-T4催化TβR Ⅰ和TβR Ⅱ的胞外段发生O-GalNAc糖基化修饰,并且这种O-GalNAc糖基化修饰衰减TβRⅠ和TβRⅡ间的相互作用;最后,利用重组表达纯化的ppGalNAc-T4与合成多肽及UDP-GalNAc在细胞外建立ppGalNAc-T4酶促反应,并以高效液相色谱分离及质谱鉴定酶促反应产物结构,对TβR Ⅰ和TβR Ⅱ胞外区肽段mapping,结果发现,重组ppGalNAc-T4酶蛋白具有酶活性,能够直接催化TβR Ⅱ胞外肽片段PHVQKSVNNDMIVTD 发生 O-GalNAc 糖基化修饰。（4）发现并确定ppGalNAc-T4通过催化TβR Ⅱ的31位丝氨酸（Ser31）发生O-GalNAc糖基化修饰下调TGF-β信号通路活性。利用Ser31位点突变的TβRⅡ胞外区肽片段与上述重组ppGalNAc-T4在细胞外重建酶促反应,结果检测不到ppGalNAc-T4酶活性。进一步,将Ser31位点突变的TβR Ⅱ在人乳腺癌细胞内表达后发现,ppGalNAc-T4特异性催化TβRⅡ的O-GalNAc糖基化修饰水平大幅度降低;同时,TβRⅠ和TβR Ⅱ的二聚体化水平升高,TGF-β信号通路激活增强。以上结果表明,ppGalNAc-T4通过影响Notch信号通路活性,调控其下游靶基因Cyclin D1和p27的表达,进而减缓细胞周期进程,抑制人乳腺癌细胞的增殖;转化生长因子β Ⅱ型受体TβR Ⅱ为ppGalNAc-T4的新底物,ppGalNAc-T4通过催化TβR Ⅱ的O-GalNAc糖基化修饰,抑制TGF-β信号通路介导的EMT过程,从而降低乳腺癌细胞的转移潜能。本论文结果揭示了 ppGalNAc-T4抑制人乳腺癌细胞增殖及转移的功能与分子机制,为深入研究ppGalNAc-Ts同工酶底物及O-GalNAc糖基化修饰功能提供了实验基础,为乳腺癌诊断、治疗与药物设计提供了新的思路,具有潜在的工程价值。