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目的：
血管生成是人体重要的生理过程,对血脑屏障的形成至关重要。影响人脑微血管生成的因子很多且复杂,近年来随着表观遗传学研究的兴起,人们发现表观遗传调控在大多数生理进程中都发挥着不可替代的重要作用,但是表观遗传调控与血管生成的关系,尤其是一些表观遗传调节因子对人脑微血管生成的影响,目前国际上报道还很少。
表观遗传调控的一个重要机制是染色质重塑,染色质重塑是基因表达调控过程中一个非常重要的环节,是由ATP提供能量的、通过依赖于ATP的染色质重塑复合物改变组蛋白与DNA的结合状念,在靠近核心组蛋白的DNA表面建立特殊的构象,使转录因子较易于接近DNA的过程。染色质重塑分子CHD4(chromodomain helicase DNA binding protein 4)属于第三类染色质重塑酶。CHD4又称Mi-2β,参与染色质重塑、转录阻遏以及DNA修复和重组等一系列基本细胞进程。在神经系统其他各组织器官的细胞分子发育进程、免疫细胞分化、造血干细胞谱系分化和癌变等一系列生理过程中发挥重要作用。CHD4和造血干细胞的发育有关,由于血细胞的发育和血管系统的发育是一个在时间和空间上紧密相连的过程,因此我们推测CHD4在血管发育中可能也发挥一定作用,因此我们有必要探讨CHD4在血管生成中的作用。关于CHD4与血管发育的关系,最近有报道称,从发育中的内皮细胞敲除Brg1会通过错误调节Wnt信号通路导致卵黄囊血管畸形,而敲除Chd4会引起卵黄囊血管系统中一系列Wnt靶基因表达上调,抑制血管畸形。血管发育中,CHD4通过直接调节Wnt应答转录因子Tcf7和一组Wnt应答靶基因的表达调控内皮细胞Wnt信号通路。从血管内皮同时敲除Chd4和Brg1可以显著回复卵黄囊血管畸形。Brg1和Chd4反向调节血管Wnt信号通路来介导卵黄囊血管生成。但目前囡际上尚无CHD4在HBMEC血管生成中的作用及其机制的报道。
本研究用RNAi方法来干扰人脑微血管内皮细胞(Human Brain Microvascular Endothelial Cell,HBMEC)中CHD4表达,希望探索其对HBMEC血管生成的影响。结果发现,CHD4通过影响HBMEC增殖调控血管生成,其具体分子机制尚需进一步探讨。
我们的研究结果可为探明在人脑微血管生成进程中CHD4主导的表观遗传调节的分子机制积累原始资料。
方法：
1、探讨不同密度HBMEC中CHD4的表达
(1)Western blot方法检测CHD4在不同密度HBMEC中表达水平;
(2)免疫荧光检测CCHD4在HBMEC中表达部位。
2、探讨瞬时干扰CHD4对HBMEC血管生成的影响
(1)瞬时干扰HBMEC中CHD4表达检测干扰效率；
(2)瞬时干扰CHD4后检测HBMEC血管生成。
3、稳定干扰HBMEC中CHD4表达对细胞迁移能力和增殖能力的影响
(1)划痕法检测瞬时干扰CHD4对HBMEC迁移能力的影响；
(2)流式检测瞬时干扰CHD4表达对HBMEC细胞周期的影响；
(3)合成CHIM shRNA稳定干扰质粒；
(4)CHD4 shRNA稳定转染到HBMEC中,Western blot方法检测以筛选出干扰效率高的克隆株；
(5)流式细胞仪检测稳定干扰CHD4表达对HBMEC细胞周期的影响。
4、探讨干扰HBMEC中CHD4表达对Eph-A受体和ephrin-A配体家族成员表达的影响
Western blot方法检测干扰CHD4后HBMEC中bFGF和Egr-1表达,而后用同样方法检测Eph-A受体和ephrin-A配体家族成员表达。
结果：
1、CHD4特异性地在细胞核表达,且表达量随细胞密度增大而增大。
(1)CHD4在较高密度HBMEC中表达水平高；
(2)HBMEC中CHD4集中在细胞核表达。
2、瞬时干扰CHD4在HBMEC中的表达抑制HBMEC血管生成。
(1)siRNA2059和siRNA2208片段对CHD4干扰效率高；
(2)siRNA2059和siRNA2208瞬时干扰CHD4后导致HBMEC血管生成能力明显减弱。
3、干扰HBMEC中CHD4表达不影响细胞迁移,但影响其增殖。
(1)瞬时干扰CHD4对HBMEC迁移能力没有影响；
(2)siRNA2059瞬时干扰CHD4表达导致HBMEC细胞周期停滞在S期；
(3)以siRNA2059片段为模板合成稳定干扰shRNA；
(4)CHD4shRNA稳定转染到HBMEC中,Western blot筛选出干扰效率最高的克隆株；
(5)稳定干扰CHD4表达导致HBMEC停滞在S期。
4、干扰HBMEC中CHD4表达使Eph-A1和Eph-A2的表达降低。
(1)瞬时干扰CHD4表达对血管生成的影响不通过Egr-1/bFGF通路发挥作用；
(2)稳定干扰CHD4的HBMEC@Eph-A1和Eph-A2表达显著降低；
(3)瞬时干扰HBMEC中CHD4的表达不影响Eph-ephrin家族其他分子的表达。
结论：
CHD4通过影响HBMEC的增殖来调控血管生成。