论文部分内容阅读
前言同型半胱氨酸(Hcy)是一种含硫的非必需氨基酸,是蛋氨酸代谢的中间产物。先天性代谢酶的缺陷及叶酸、维生素B6、维生素B12的缺乏,均会导致同型半胱氨酸在体内积蓄,形成高同型半胱氨酸血症。近年来的研究显示,高同型半胱氨酸血症不仅是动脉粥样硬化的高危因素,而且与多种神经变性疾病发病密切相关。其具体的致病机制还不完全清楚。目前多项研究证实,同型半胱氨酸能够在不同细胞类型,通过复杂的信号转导途径激活细胞外信号调节激酶(ERK1/2)。ERK1/2是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的重要成员,它广泛参与了细胞多种生理过程,如生长、发育、分化和增殖等。许多信号转导途径均会导致ERK1/2的激活。上皮生长因子受体(EGFR)转活途径是近几年发现的一种新颖的信号转导途径。它通过G蛋白偶联受体(GPCR)激活,导致细胞自身某种生长因子的释放,进而激活自身和相邻细胞的上皮生长因子受体(EGFR),诱导ERK1/2的激活。众所周知,同型半胱氨酸是内源性谷氨酸受体激动剂,能促进神经突触谷氨酸的释放。在多项同型半胱氨酸的毒性实验中,谷氨酸受体拮抗剂能够阻断同型半胱氨酸诱导的ERK1/2的磷酸化。而谷氨酸受体也是一种G蛋白偶联受体(GPCR)。因此这里我们重点研究,在原代培养的小脑颗粒神经元,同型半胱氨酸是否可以通过谷氨酸受体介导的上皮生长因子受体(EGFR)转活途径激活ERK1/2,希望为探讨同型半胱氨酸的毒性机制提供帮助。方法选取出生7天CD—1小鼠,进行小脑颗粒神经元原代培养。将培养7天的神经元,随机分四组:对照组、药物组、Hcy处理组、药物和Hcy处理组。换成不含血清培养液后,先加入药物及其相应对照液预处理15分钟,再加入Hcy及其对照液37℃5%CO2温箱孵育20分钟,弃上清,PBS液冲洗,加入细胞裂解液,收集细胞。匀浆后的样品进行SDS免疫凝胶电泳,采用Western印迹法半定量测定磷酸化的ERK1/2。使用SPSS12.0软件进行统计分析,多组资料用One—Way ANOVA方法进行比较。p＜0.05表示差异有统计学意义结果1、在原代培养的小脑颗粒神经元,同型半胱氨酸可以诱导迅速而短暂的ERK1/2磷酸化,此作用在20分钟时最明显。2、同型半胱氨酸引起ERK1/2磷酸化可以被谷氨酸NMDA受体拮抗剂MK-801和非NMDA受体拮抗剂CNQX所阻断,提示同型半胱氨酸通过兴奋谷氨酸受体激活ERK1/2。3、上皮生长因子受体特异性拮抗剂AG1478和金属蛋白酶抑制剂GM 6001可以阻断同型半胱氨酸引起的ERK1/2磷酸化,提示同型半胱氨酸可以通过上皮生长因子受体转活途径诱导ERK1/2磷酸化,此过程需要金属蛋白酶的参与。结论在原代培养的小鼠小脑颗粒神经元,同型半胱氨酸可以通过谷氨酸受体介导的上皮生长因子受体(EGFR)转活途径,诱导迅速而短暂的ERK1/2激活。此过程需要金属蛋白酶的参与。