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目的阐述miR-491对肝癌肿瘤干细胞特性获得的分子调控机制及其对肝细胞肝癌发生发展及预后复发的影响,为今后肝癌发生发展及预后复发的诊断、靶向治疗以及患者预后预测提供新的途径和研究思路。方法一、miR-491和肿瘤干细胞特性均与肝癌转移潜能和分化程度相关1.高、低分化肝癌组织miRNA表达差异检测：人miRNA OneArray(?) v4miRNA芯片筛选高、低分化肝癌组织中差异性miRNA表达；2.肝癌细胞和组织miR-491和肿瘤干细胞表面抗原水平检测：实时定量逆转录PCR (qRT-PCR)方法检测miR-491、CD44、CD90和EpCAM在不同转移潜能肝癌细胞系和不同分化程度肝癌组织中表达水平；二、miR-491影响肝癌细胞肿瘤干细胞特性获得miR-491表达水平变化对肝癌细胞肿瘤干细胞表面抗原及肿瘤干细胞成球能力影响检测：肝癌细胞MHCC97H和HepG2内分别转染miR-491mimic/inhibitor, qRT-PCR方法检测CD44. CD90和EpCAM表达水平变化,悬浮克隆细胞球形成实验检测肿瘤干细胞成球能力变化。三、miR-491在肝癌细胞系中通过GIT1/ERK调(?)NF-κB/snail1.miR-491表达水平变化对肝癌细胞NF-κB和snail表达影响检测：肝癌细胞MHCC97H和HepG2内分别转染miR-491mimic/inhibitor, Western blot检snail、 NF-κB蛋白及磷酸化水平变化；2.miR-491表达水平变化对肝癌细胞NF-κB DNA结合能力的影响：Southwestern blot方法检测转染miR-491mimic的MHCC97H细胞中NF-κB与KB序列DNA结合能力。3.miR-491表达水平变化对肝癌细胞GIT1的影响检测：肝癌细胞MHCC97H内共转染pGL3-GIT13’UTR (wt)-Luc和miR-491-mimic,荧光素酶报告基因实验检测GIT1荧光素酶活性变化；4.GIT1表达水平变化对肝癌细胞ERK、NF-κB的影响检测：肝癌细胞MHCC97H内转染GIT1siRNA或con-siRNA后,Western blot检测ERK、NF-κB蛋白及磷酸化水平变化；5.ERK表达水平变化对肝癌细胞NF-κB的影响检测：肝癌细胞HepG2内转染miR-491inhibitor24h后,继续用GIT1siRNA或con-siRNA分别处理细胞12h, Western blot检测NF-κB蛋白及磷酸化水平变化。四、NF-xB/snail对肝癌细胞EMT和肿瘤干细胞特性获得的影响1.肝癌细胞和组织4F-κB、snail表达水平检测：qRT-PCR方法检测NF-κB、 snai在不同转移潜能肝癌细胞系和不同分化程度肝癌组织中表达水平；2. NF-κB表达水平变化对肝癌细胞snail和EMT标志指标的影响：肝癌细胞MHCC97H内转染p65siRNA,用显微镜观察细胞形态,Western blot检钡snail、 E-cadherin和Vimentin蛋白水平变化；3. NF-κB表达水平变化对肝癌细胞肿瘤干细胞表面抗原及肿瘤干细胞成球能力影响检测：肝癌细胞MHCC97H和MHCC97L内转染p65siRNA, qRT-PCR方法检钡CD44、CD90和EpCAM表达水平变化,悬浮克隆细胞球形成实验检测肿瘤干细胞成球能力变化。五、miR-491和肿瘤干细胞特性均与肝癌复发相关1.对肝癌患者出院后随访有无复发或死亡,并进行预后评估：根据以上有关检测指标,结合影像学、血清学、病理学诊断和临床一般资料对肿瘤分期(巴塞罗那标准)、复发情况和预后进行评估。2.根据随访结果对肝癌组织重新分组,检测miR-491和肿瘤干细胞表面抗原与肝癌复发的关系：qRT-PCR方法检测miR-491、CD44、CD90和EpCAM在肝癌未复发组和复发组中表达水平。结果一、miR-491和肿瘤干细胞特性均与肝癌转移潜能和分化程度相关1.高、低分化肝癌组织miRNA表达差异：人niRNA OneArray(?) v4miRNA芯片筛选出表达升高3倍或降低至1/3以下的miRNA41个,包括13个上调,28个下调,其中低分化组miR-491下降至0.15。2. qRT-PCR方法分别检测肝癌细胞系和组织miR-491表达水平结果发现：miR-491表达与细胞转移潜能及肝癌组织分化程度呈负相关,而CD44、CD90和EpCAM表达与细胞转移潜能及肝癌组织分化程度呈正相关。二、miR-491影响肝癌细胞肿瘤干细胞特性获得结果发现转染miR-491mimic的MHCC97H细胞CD44.CD90和EpCAM的mRNA表达和肿瘤干细胞成球能力较对照组显著降低；而转染miR-491inhibitor的HepG2细胞干细胞表面抗原CD44、CD90和EpCAM的mRNA表达和肿瘤干细胞成球能力较对照组明显升高。三、miR-491在肝癌细胞系中通过GIT1/ERK调控NF-κB/snail1.在肝癌细胞MHCC97H中上调miR-491后,结果发现snail和p-p65蛋白水平均明显升高；而肝癌细胞HepG2下调miR-491后,snail和p-p65蛋白水平均明显下降；2.通过Southwestern blot方法检测NF-κB与κB序列DNA结合能力,发现在MHCC97H细胞中导入miR-491后,可以阻止NF-κB与κB序列DNA结合。结果说明在肝癌细胞中miR-491能够调控NF-κB的DNA结合活性。3.肝癌细胞MHCC97H内共转染pGL3-GIT13’UTR (wt)-Luc和miR-491-mimic,结果发现GIT1与miR-491启动子区能够结合,上调miR-491水平,野生型GIT1荧光素酶活性下降,说明在肝癌细胞中,miR-491可以直接靶向调控GIT1；4.在MHCC97H细胞中关闭GIT1,结果发现MHCC97H细胞中p-p65和p-ERKs的蛋白水平均明显下降。说明关闭GITl能阻滞ERK和NF-κB的表达。5.使用anti-miR-491或anti-con处理HepG2细胞24h后,再用0.0和10.0μMERK抑制剂U0126处理HepG2细胞12h后,结果发现抑制ERK可使anti-miR-491所致HepG2细胞NF-κB的蛋白水平升高回降。说明anti-miR-491所致肝癌细胞NF-κB表达上调是通过ERK信号通路来完成的。四、NF-κB/snail对肝癌细胞EMT和肿瘤干细胞特性获得的影响1. qRT-PCR检测NF-κB、snail在不同转移潜能肝癌细胞系和不同分化程度肝癌组织中表达水平结果发现：NF-κB和snail的表达与肝癌细胞系转移潜能和肿瘤分化程度均呈正相关；2.肝癌细胞MHCC97H内转染!NF-κB p65siRNA,结果观察到细胞形态由纺锤状的间充质形态向上皮形态转变,上皮标志蛋白E-cadherin较对照组明显升高,而间质标志蛋白Vimentin以及snail蛋白水平较对照组显著下降。提示NF-κB的失活抑制了肝癌细胞的EMT进程,并且snail参与了NF-κB信号通路调控EMT的过程；3.肝癌细胞MHCC97H和MHCC97L内转染p65siRNA后,结果发现CD44、CD90和EpCAM mRNA表达水平均显著下降,同时肿瘤于细胞成球能力亦明显减弱。五、miR-491和肿瘤干细胞特性均与肝癌复发相关肝癌患者术后随访结果发现：低分化组两年内肝癌复发率显著高于高分化组,但术后两年死亡率未见显著差异。与肝癌未复发组相比,复发组切除的肝癌组织中miR-491的表达显著降低,而肿瘤干细胞表面抗原CD90和EpCAM的mRNA表达均明显升高。说明miR-491与肝癌术后复发率呈负相关,而肿瘤干细胞特性与肿瘤复发率呈正相关。结论1.miR-491和肿瘤干细胞特性均与HCC转移潜能及分化程度相关；2.miR-491在肝癌细胞中抑制HCC肿瘤干细胞特性获得；3.miR-491通过靶蛋白GITl调控ERK/NF-κB;4. NF-κB/snail信号通路参与了HCC的EMT和肿瘤干细胞特性获得过程。5.miR-491和肿瘤干细胞特性均与肝癌复发相关总之,本研究结果提示miR-491可以通过调控靶蛋白GIT1降低ERK活性,下调NF-KB/snail信号通路,进而阻滞EMT进程,最终抑制肝癌干细胞特性获得。本研究结果说明miR-491与肝癌干细胞特性获得的通路调控在肝癌发生发展和预后复发中发挥重要作用。