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谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase,又称转谷氨酰胺酶,EC2.3.2.13,TGase或TG)能够催化蛋白质肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基与各种酰基受体发生酰胺基转移反应,是一种有效的蛋白质交联剂。TG广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。其中,微生物谷氨酰胺转胺酶(Microbial transglutaminase, MTG)被广泛用于食品工业以改善蛋白质的功能性质、提高营养价值。近些年,MTG在化妆品行业、纺织业、皮革业及生物材料领域也表现出良好的应用前景。MTG的主要生产菌株是链霉菌,如茂源链霉菌(Streptomyces mobaraense),吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)等。由于原产菌株分子改造困难、产量提高潜力有限且自身分泌的大量蛋白酶,使用异源系统(如大肠杆菌、棒杆菌、酵母等)生产MTG已成为近几年的研究趋势,但目前异源系统的MTG生产水平离产业化还有较大差距。毕赤酵母(Pichia pastoris)是近二十年来发展出的最为成功的表达系统之一,前人研究也表明毕赤酵母可直接分泌表达具有活性的MTG,但其蛋白表达量仍较低。本研究从菌株改造和工艺优化两方面入手,尝试在毕赤酵母系统中实现MTG的高效表达。首先从茂原链霉菌基因组中克隆得到MTG原序列pro和成熟肽基因,构建得到酶原序列和成熟肽基因共表达载体pAOa-pro-MTG,并进一步构建得到2拷贝和3拷贝表达载体pAOa-2pro-2MTG和pAOa-3pro-3MTG。其次,将1-3拷贝载体转化毕赤酵母得到了含不同拷贝数重组工程菌株GS1MTG. GS2MTG和GS3MTG。通过摇瓶发酵确定2拷贝菌株GS2MTG产酶酶活力最高。然后通过优化发酵培养基和发酵pH值确定GS2MTG最佳发酵培养基是BMMY, pH值为6.0-7.0。最后在1L发酵罐上,通过重组毕赤酵母菌株GS2MTG高密度发酵,获得了7.3U/mL的产量。为了克服毕赤酵母重组蛋白表达上常见的分泌限制,进一步提高MTG的产量,本研究通过共表达毕赤酵母蛋白伴侣的策略来提高酵母对于MTG的分泌能力。为了达到上述目的,首先建立了毕赤酵母的蛋白伴侣文库,将毕赤酵母中重要的蛋白伴侣基因逐一进行过表达。先期选取了13个蛋白伴侣,分别为A674、SSO、A156、B27、KAR、 B357、PDI、C467、FB40、B424、B230、FD002和B582。然后将2拷贝MTG表达载体逐一转化到该文库的重组菌中,最终得到7株蛋白伴侣与MTG共表达的工程菌株,分别为GS2MTG-SSO、GS2MTG-A156、GS2MTG-B27、GS2MTG-KAR、GS2MTG-B357、 GS2MTG-PDI和GS2MTG-C467。通过摇瓶发酵比较发现,GS2MTG-C467和GS2MTG-KAR与GS2MTG相比酶活力提高了90.2%和21.5%。通过本研究的开展,成功获得了多株MTG的高产菌株以及优化的发酵工艺,使MTG的产量在发酵罐水平达到7.3U/mL。这是目前已知的采取活性表达策略报道中产量水平最高的,显示了毕赤酵母用于MTG生产的可行性,也为该技术实现工业化规模生产奠定坚实的基础。