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研究背景:在HIV病毒感染靶细胞的过程中,人体内天然存在的多种淀粉样多肽,如SEVI(精液源性的病毒增强因子),Aβ(老年痴呆蛋白)等可显著提高病毒感染靶细胞的效率。本实验室在前期研究中发现人工合成的位于gp120MNβ区的多肽能形成淀粉样纤维并能促进HIV病毒的感染,提高ARV药物的IC50。在人体复杂的生理环境中,是否存在来源于病毒本身的感染增强因素?淀粉样多肽在HIV感染的过程中是否天然存在?诱导其形成的因素是什么?gp120在体内多种酶的作用下能否降解成为小的多肽片段并产生一定的生理效应?研究目的:拟采用多肽组学结合高分辨质谱法(LC-MS/MS)分别从gp120体外酶解产物,病毒感染靶细胞上清液,HIV阳性患者的血浆及淋巴漏液中寻找HIV包膜蛋白gp120来源的淀粉样多肽。分别使用免疫荧光,免疫胶体金技术确定病毒感染上清液及患者淋巴漏液中淀粉样纤维的存在与组成,免疫组化结合刚果红染色对患者的淋巴结进行分析,确定患者淋巴结中淀粉样纤维的存在与组成。通过病毒感染增强实验评价所鉴定的多肽对病毒感染靶细胞及临床抗病毒药物IC50的影响。本研究为深入理解HIV病毒的非基因耐药新机制,优化HIV临床治疗方案提供理论参考。方法与结果:为检测体液中酶对gp120稳定性的影响,分别选用α-L-AFU、Thrombin B、Plasmin、CathepsinB四种酶对gp120JRFL蛋白进行体外酶促反应,10%SDS-PAGE电泳结合考马斯亮蓝染色发现gp120蛋白在不同时间点均存在不同程度降解,透射电镜(TEM)下酶解产物可自发形成淀粉样纤维。为验证HIV病毒感染靶细胞的过程中能否自发产生gp120来源的多肽,我们在体外模拟了病毒体内的感染过程。分别采用不同嗜性病毒X4嗜性(HIVIIIB)感染MT-2细胞及R5嗜性(HIVSF162)病毒感染CEMx174 5.25M7细胞,感染7天后离心除去细胞及细胞碎片收取上清。免疫荧光及免疫胶体金法检测到感染上清中存在gp120来源的淀粉样纤维。为验证临床样本中是否存在gp120来源多肽,是否存在促进病毒感染的因素。免疫荧光与免疫胶体金检测到淋巴漏液中存在gp120来源的淀粉样纤维。免疫组化与刚果红染色实验表明HIV阳性患者淋巴结中gp120蛋白表达量较高且与淀粉样物质存在共定位。进一步实验发现灭活的淋巴漏液可以浓度依赖性的促进R5嗜性(HIVSF162)克隆病毒感染靶细胞。为鉴定多肽具体序列,分别使用超滤法处理gp120体外酶解产物,OMC材料吸附,免疫亲和,乙腈沉淀法结合超滤法对感染上清,淋巴漏液进行样本预处理。高分辨质谱LC-MS/MS鉴定并发现了一系列gpl20来源多肽。序列同源比对分析多肽在gp120上的定位及可能的二级结构,选择性合成了具有β结构域的部分多肽。采用刚果红,硫磺素T特异性染色,透射电镜TEM,圆二色谱CD等验证多肽是否可形成淀粉样纤维并具有典型的β折叠。病毒感染活性实验表明 GAP380-396、GAP229-244、GAP354-369 多肽对克隆病毒,GAP380-396、GAP229-244多肽对临床株病毒具有感染增强作用。GAP380-396、GAP229-244多肽使四种临床抗病毒药物的IC50升高。为解析多肽增强病毒感染的机制,用Zetasizer Nano ZS电势测量仪检测了GAP380-396、GAP229-244多肽的电势,竞争性结合实验检测了电荷因素对病毒感染的作用。发现CS对带有正电荷的GAP229-244多肽的病毒增强感染能力具有部分拮抗作用,对负电荷GAP380-396及几乎不带电荷的EP2多肽无影响。采用Virus pull-down进一步检测多肽纤维沉淀与上清对病毒的感染性,发现仅有沉淀部分可增强病毒感染,说明多肽纤维可捕获并结合病毒。Cell-binding及荧光病毒结合实验发现多肽可通过结合病毒与细胞膜来增强病毒感染。荧光多肽显示不同多肽之间可形成杂合多肽且仍保持增强病毒感染能力,多肽之间可能具有叠加效应。XTT实验显示多肽与病毒对Tzm-bl细胞无毒性。结论:分别从HIV gp120的体外酶解产物,感染上清,临床样本淋巴漏液中鉴定出来源于gp120β-片层能形成淀粉样纤维的多肽GAPs及能促进病毒感染的淀粉样纤维GEVI。体液中存在的酶的催化作用可能是gp120降解形成多肽的原因之一。GAPs多肽可促进HIV病毒感染及并拮抗抗病毒药物活性,且不同多肽之间具有增强感染的叠加效应。这种感染增强效应可能是静电及其疏水效应共同作用的结果。本研究为深入理解HIV病毒感染增强效应,非基因突变引发的耐药问题提供理论依据,为HIV的临床治疗提供了改进方向。