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鸡杆菌（Gallibacterium）属于巴氏杆菌科新成立的一个属，包括输卵管炎放线杆菌(A salpingitidis）、鸭巴氏杆菌（Pasteurella anatis）、鸭源鸡杆菌（Gallibacterium anatis，G.anatis）和禽类溶血性巴氏杆菌（Avian P.haemolytica-like），而鸭源鸡杆菌（Gallibacterium anatis.G anatis）则为代表种，属于革兰氏性阴菌。研究发现鸭源鸡杆菌属于条件致病菌，不但是构成鸡上呼吸道及下生殖道正常菌群的一部分，而且在一定条件下引起蛋鸡腹膜炎、输卵管炎等生殖道疾病和呼吸道等疾病，造成产蛋量和产蛋质量下降、死亡率上升。G.anatis存在多重耐药及抗原多样性，导致抗生素的防治效果越来越不理想，从而给养殖业造成巨大的经济损失。目前对于G.anatis的治病机理的研究和疫苗的研发十分有限，仅有几个预测到的毒力因子得到认证，但是其致病机制仍未被阐明。本试验首次针对G anatis外膜蛋白A(OmpA)进行初步探究，借助PCR和生物信息学方法，成功得到ompA基因，并对其在G.anatis中的分布状态做了了解，对可能存在的抗原表位进行了预测，用重组外膜蛋白A制备了兔源多克隆抗体，从而对其免疫原性进行了研究，通过将重组蛋白制备疫苗免疫小鼠，对其免疫保护性有了了解。为了进一步了解ompA基因功能，本试验利用靶向基因操作技术尝试对ompA基因进行缺失。 1、鸭源鸡杆菌外膜蛋白A基因克隆与功能分析 参照GenBank上公布的UMN179的ompA核苷酸序列，设计一对特异性引物用以扩增并克隆ompA全基因序列。对扩增出的G anatis ompA基因，通过生物信息学相关软件对OmpA的氨基酸序列进行分析，预测其结构特征及可能存在的B细胞抗原表位。结果显示23株G anatis均存在ompA基因，并且高度保守;其三级结构预测分析显示OmpA为β桶状孔道结构，由10个反向平行β折叠片构成;不同的G.anatis之间存在相同的B细胞抗原表位，表明不同菌株之间可能存在交叉免疫原性。本试验为进一步研究G anatis ompA基因功能奠定了基础，也为G anatis诊断方法的建立及疫苗的研制提供能参考依据。 2、鸭源鸡杆菌外膜蛋白A基因的原核表达、抗原性及免疫原性鉴定 设计特异性引物扩增G anatis的去信号肽ompA基因，连接到原核表达载体pET32a(+)，成功构建了原核表达载体pET32a(+)-OmpA，并且在BL21大肠杆菌中得到了表达;SDS-PAGE分析显示，重组蛋白主要以包涵体的形式表达;Western blotting结果显示重组蛋白能够与G anatis阳性血清发生特异性结合，而不同菌株也能够与兔源OmpA多抗血清发生特异性结合，这表明OmpA具有良好的免疫原性和反应原性，具有成为具有交叉免疫保护性疫苗的潜能。 3、鸭源鸡杆菌重组外膜蛋白A的免疫保护性研究 将纯化的重组蛋白rOmpA和灭活全菌分别制成疫苗免疫小鼠，同时设立PBS对照组。共免疫三次，每次免疫间隔两周，每次免疫后7d小鼠断尾采血并分离血清，通过ELISA检测抗体效价。三免后14d进行攻毒，结果表明:rOmpA组和全菌灭活苗组抗体水平明显高于对照组;rOmpA组和全菌灭活苗组存活率达到50％与80％,而PBS对照组小鼠全部死亡。这些均表明OmpA能够诱导小鼠产生保护性抗体，为进一步研究G anatis OmpA功能进而防治鸡输卵管炎、腹膜炎等疾病奠定基础。 4、鸭源鸡杆菌ompA基因缺失突变株的构建 根据GenBank上公布的UMN179全基因序列，设计特异性引物，扩增ompA基因上下游同源臂，选择卡那抗性盒子作为筛选标记，以G anatis YU-PDS-RZ-1-SLG株基因组为模板扩增ompA基因上下游同源譬，克隆至pMD18-T载体中构建重组质粒pMD18-U-D，随后将卡那抗性基因插入到上下游同源臂之间，构建同源重组载体pMD18-U-K-D，利用PCR方法扩增转化片段U-K-D，通过自然转化法转入到G anatis感受态细胞，目前已经取得突破性进展。