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研究背景国内外近年应用蛛网膜下腔-硬膜外腔联合阻滞的数量增加,国内椎管内麻醉约占总麻醉病例的50%(＞10,000,000例/年),局麻药(local anesthetics,LA)中轴与周围神经毒性损伤不仅为临床麻醉与疼痛治疗中的并发症,且易引起医疗纠纷,困扰麻醉或疼痛科医师,近年相关研究与流行病学调查报道增多,LA中轴与周围神经毒性成为麻醉学与疼痛治疗学领域关注的重点。椎管内与周围神经阻滞后,有关其组织病理学及功能损害确切由LA神经毒性所致之发病率报道,依据药物种类、阻滞部位与方法,差异较大,症状亦随之轻重不一。LA的脊神经毒性反应,近年来对一过性神经病学综合症(TNS)极为关注,其临床表现为:蛛网膜下腔阻滞后出现下肢疼痛和(或)感觉迟钝或过敏,可伴有下肢无力、麻木、感觉异常或尿潴留等神经症状。尽管其发病机理有多种不同观点,LA本身对神经的毒性为病因之一。持续时间一般在蛛网膜下腔阻滞完全恢复后24h内,少数可达2d或5d甚至10d。新型酰胺类长效LA罗哌卡因问世以来,随着其应用逐渐增多,布比卡因逐渐减少,LA的急性全身毒性反应发生率呈下降趋势,尤其急性心血管毒性反应发生率下降更为显著,但目前尚无充分证据表明其中轴与周围神经毒性损伤反应的发生明显减少。因而罗哌卡因中轴与周围神经毒性对运动、感觉功能的损害程度,持续时间的长短,及可逆性程度大小是目前研究的热点。尤其较全面了解其病因学与机理,可为临床研究LA神经毒性的预防与处理措施提供理论依据。丝裂原性活化蛋白激酶(mitogen- activated protein kinase,MAPK)属于丝氨酸—苏氨酸蛋白激酶大家族,主要包括细胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulated kinases,ERKs)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-teminal kinases,JNKs)和p38激酶。部分学者通过探讨LA周围神经毒性损伤与信号转导间的关系,发现LA可通过诱导MAPK相关的信号转导系统导致神经细胞凋亡,同时发现p38激酶抑制剂SB203580对利多卡因所致神经毒性损伤具有神经保护作用,可减少体外培养的神经元细胞凋亡。而罗哌卡因是否通过诱导MAPK相关的信号转导系统导致神经细胞凋亡目前并无研究报道。白藜芦醇苷(polydatin,PD)为天然白藜芦醇(resveratrol,Res)的葡萄糖苷形式,前者在体内水解为Res,其能有效抑制p38激酶激活,减少线粒体内细胞色素c的释放,减弱半胱天冬酶复合物的活化,进而抑制细胞凋亡。研究发现Res可减轻外伤性脊髓损伤,促进神经再生及功能恢复。Res上述作用可否应用于防治LA引起的周围神经毒性损伤,尚无研究证实。牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液(Ext ract f rom Rabbit Skin Inflamed byVaccinia Virus for Injection,AGC)系在健康家兔皮内接种人用牛痘病毒活疫苗,经过炎症和免疫反应所产生的非蛋白性生物活性物质,再经过提纯所得。其具有神经修复和免疫调节作用,对神经损伤或其他疾病所致的慢性疼痛、冷感、麻木等神经系统症状有显著疗效。由于牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液是一个多组分的生物制品药物,其中存在多种有效成分,进一步确定不同的药效和药理作用是一项具有重要学术和应用价值的研究。本研究探讨牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液对LA引起的周围神经毒性损伤是否有缓解作用。本研究探讨罗哌卡因是否通过诱导MAPK相关的信号转导系统导致神经细胞凋亡,以及PD、AGC对罗哌卡因引起的周围神经毒性损伤的影响,进一步明确他们对神经保护的机制,也为其他药物治疗神经损伤提供参考。第一部分白藜芦醇苷对2%罗哌卡因间断鞘内注射大鼠后肢感觉运动功能的影响目的探讨白藜芦醇苷对间断鞘内注射2%罗哌卡因,大鼠后肢感觉、运动功能的影响。方法健康成年雄性SD大鼠18只,随机分为假手术(S)组、罗哌卡因(R)组、白藜芦醇苷(PD)处理组,每组6只。按改良法于L3-4蛛网膜下腔置管,于建立模型后2d,对无感觉运动异常大鼠在非麻醉状态下经PE-10导管给药。其中,PD组先肌注PD 10mg/kg,2h后经蛛网膜下腔导管给予2%罗哌卡因40ul,此后每天一次PD,共给5天。S组、R组肌注生理盐水1ml,给药时间同PD组。S组经蛛网膜下腔导管注入人工脑脊液40μl,每1.5h一次,共3次。R组、PD组经导管注入2%罗哌卡因40μl,给药时间同S组。各组于给药前及给药后5天每天观察大鼠后肢的活动情况,并用热板仪、压痛仪及后肢撑力实验对其感觉、运动功能进行检测。采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,数据结果用均数±标准差((?)±s)表示。采用重复测量对结果进行统计分析,P＜0.05表明差异有显著性。结果S组无感觉、运动功能损伤,与S组相比R组出现感觉、运动功能损伤,其后肢热痛阈、压痛阈和肌力在2d、3d及4d时点差异有统计学意义,PD组与S组相比无显著性差异。结论PD能减轻大鼠蛛网膜下腔间断鞘内注射2%罗哌卡因造成的大鼠后肢感觉、运动功能损伤。第二部分PD对2%罗哌卡因间断鞘内注射大鼠背根神经节细胞凋亡数量及p-p38MAPK表达的影响目的观测PD对大鼠蛛网膜下腔间断鞘内注射2%罗哌卡因后背根神经节神经元细胞形态结构、凋亡细胞和P-P38表达的影响。方法健康成年雄性SD大鼠30只,自由饮食,体重280～330克,标准环境饲养(温度23±0.5℃,湿度50±0.5%)。随机分为空白对照组(N组)、假手术组(S组)、罗哌卡因组(R组)、SB203580组(SB组)及PD处理组(PD组)每组6只。N组不置管不予药物处理。PD组先肌注PD 10mg/kg,SB组先鞘内给2%罗哌卡因前经导管给予SB203580 5ug,两组均于2h后经蛛网膜下腔导管给予2%罗哌卡因40ul,此后每天一次PD,共给5天。S组、R组肌注生理盐水1ml,给药时间同以上两组组。S组经蛛网膜下腔导管注入人工脑脊液40μl,每1.5h一次,共3次。R组、PD组、SB组经导管注入2%罗哌卡因40μl,给药时间同S组。于给药后3d处死取大鼠背根神经节。HE染色观察神经元形态变化;TUNEL法观察神经元凋亡数量;免疫组化与Western blot观察p-p38蛋白表达情况。采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,数据结果用均数±标准差((?)±s)表示。神经元凋亡数目、p-p38阳性细胞数目采用单因素方差分析(One-way ANOVA),P＜0.05示差异有显著性。结果1.HE染色:N组及S组大鼠背根神经节神经元细胞形态、结构正常。R组有部分神经元细胞萎缩和空泡化。SB组及PD组神经细胞变性、坏死数量明显少于R组。2.凋亡检测:N组和S组有少量凋亡细胞,与N组和S组相比R组凋亡细胞数量增加差异均有统计学意义(P＜0.05),而PD组和SB组均无显著差异。3.p-p38检测:N组、S组有少量P-P38阳性细胞,与S组相比R组P-P38阳性细胞数量增加且差异有统计学意义(P＜0.05),而PD组和SB组均无显著差异。与N组相比R组、PD组、SB组阳性细胞数量增加且差异有统计学意义(P＜0.05)。结论p38MAPK信号通路参与鞘内注射罗哌卡因后大鼠背根神经元细胞的凋亡,PD可通过抑制p-p38的表达减少背根神经节神经元细胞的凋亡,从而减轻罗哌卡因所致感觉运动神经损伤,同时p-p38的规律表达可用于鞘内注射罗哌卡因对大鼠神经毒性影响的研究。第三部分牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液对2%罗哌卡因间断鞘内注射大鼠后肢感觉、运动功能的影响目的探讨牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液对间断鞘内注射2%罗哌卡因大鼠后肢感觉、运动功能与背根神经节神经元凋亡数目的影响。方法健康成年雄性SD大鼠36只,采用完全随机设计方法,随机分为假手术组(S组)、罗哌卡因组(R组)、牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液处理组(AGC组),每组12只。其中6只用于感觉运动功能测定,6只用于背根神经元凋亡检测。按改良法于L3-4蛛网膜下腔置管,于建立模型后2d,对无感觉运动异常大鼠在非麻醉状态下经PE-10导管给药。其中,AGC组先肌注AGC 10U/kg/d,2h后经蛛网膜下腔导管给予2%罗哌卡因40ul,此后每天一次AGC,共给5天。S组、R组肌注生理盐水1ml,给药时间同AGC组。S组经蛛网膜下腔导管注入人工脑脊液40μl,每1.5h一次,共3次。R组、AGC组经导管注入2%罗哌卡因40μl,给药时间同S组。用热板仪、压痛仪及后肢撑力实验对其感觉、运动功能进行测定。TUNEL法观察神经元凋亡数量。采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,数据结果用均数±标准差((?)±s)表示。神经功能指标采用重复测量对结果进行统计分析,神经元凋亡数目采用单因素方差分析(One-way ANOVA),P＜0.05示差异有显著性。结果S组无感觉、运动功能损伤,与S组相比R组出现感觉、运动神经损伤,其后肢热痛阈、压痛阈和肌力,在2d、3d及4d时间点,差异有统计学意义。AGC组与S组相比无显著性差异。结论AGC能够减轻大鼠蛛网膜下腔间断注射2%罗哌卡因造成的大鼠后肢感觉运动功能损伤评分。