论文部分内容阅读
胰岛素( insilin)和类胰岛素多肽（insulin-related peptides）是调节生长和代谢过程中主要的激素，在脊椎动物和非脊椎动物中均发现了类胰岛素多肽，包括哺乳动物、原索动物、线虫、软体动物和昆虫。这些激素通过类似胰岛素受体( insulin receptor)的异源四聚体跨膜受体酪氨酸蛋白激酶相互作用而发挥其功能。目前，国内外对胰岛素结合蛋白(insulin-related binding proteins, IBP)的研究多数集中在脊椎动物上，而对非脊椎动物的研究很少。
我们从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条编码类胰岛素结合蛋白(insulin-related binding protein)的基因，我们将其命名为Bm IBP(Bombyx mori insulin-relatedbinding protein), GenBank登录号为DQ443372.1。该基因的ORF为768bp，编码255个氨基酸残基，是由六个外显子和五个内含子剪接而成。将推测的氨基酸序列进行同源性( BlastP)比对，发现此蛋白序列含有两个保守的IG domains，生物信息学预测其分子量为27.98kD，等电点为7.36。
我们利用大肠杆菌表达系统成功表达了含有His标签的BmIBP融合蛋白，主要以包涵体形式存在。镍柱纯化后获得较纯的融合蛋白，将其为抗原免疫新西兰白兔，制备该融合蛋白的多克隆抗体。ELISA检测该抗血清（多克隆抗体）的效价可达到1:12800。用制备的多克隆抗体进行Western blotting检测发现，BmIBP蛋白在家蚕五龄幼虫卵巢、精巢、脂肪体、马氏管和头等组织和家蚕卵、蛹、蛾期的发育阶段均有表达。实时荧光定量PCR的结果表明，家蚕Bm IBP mRNA在家蚕的各个发育时期及不同组织中广泛存在，在蛹期和五龄幼虫中的卵巢、肠和马氏管中表达量最高。用获得的多克隆抗体进行亚细胞定位，信号显示BmIBP蛋白主要定位在家蚕Bm5细胞的细胞质中。