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目的: 观察睾丸支持细胞与不同分化阶段的胚胎干细胞共培养条件下，胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的不同阶段细胞的MHC分子、FAS-L分子表达的情况，以明确睾丸支持细胞对胚胎干细胞向成熟细胞分化过程中胚胎干细胞免疫原性的影响，力图寻求一种能降低胚胎干细胞源性成熟细胞的免疫原性、诱导宿主免疫耐受的方法来，为糖尿病细胞移植治疗的抗移植排斥策略的制定提供理论和实验依据。 方法: 1.睾丸支持细胞的制备:取一个月的雄性昆明小鼠的睾丸组织，经Ⅰ型胶原蛋白和胰蛋白酶消化成细胞悬液，离心收集细胞，接种于含15％胎牛血清的DMEM培养基中。经低渗处理去除生精细胞后可得到纯度接近90％的睾丸支持细胞。睾丸支持细胞形态、由HE染色和油红O染色鉴定。 2.MEF的制备:取孕13.5d的小鼠的胚胎，去除头尾、内脏和四肢后用PBS清洗，充分剪碎(1-3mm3)后再用0.25％胰酶(Trypsin)-0.02％EDTA溶液分“3-阶段”消化成细胞悬液，离心收集细胞，传代纯化后备用。 3.ESC的扩增:小鼠胚胎干细胞(ESC)接种于经丝裂霉素处理1h后的MEF饲养层上，加入ESC培养液(15％胎牛血清，1000IU/mL白血病抑制因子(LIF)和DMEM高糖培养液），每天换液1次，连续培养扩增3-4d按1∶3-4比例传代扩增。 4.ESC向IPC分化诱导:采用本实验室传统的分阶段诱导法。实验组由睾丸支持细胞与胚胎干细胞分化得到的拟胚体(EB)共培养，然后进行向胰岛素分泌细胞分化的定向诱导;对照组不接种睾丸支持细胞。另外设置一组睾丸支持细胞对照组。具体方法见下: 4.1拟胚体(embryonic bodies，EB)的形成:将培养4-5d的ESC用0.25％胰酶(Trypsin)-0.02％EDTA消化为单细胞，离心收集细胞，接种于低粘附性的细菌培养皿中，添加含有15％胎牛血清的DMEM高糖培养液，悬浮培养4-5d，使ESC自发分化为EB。 4.2 nestin阳性细胞(nestin positive cells，NPC)的形成:收集培养4-5d的EB，转种于预先用Ⅰ型胶原蛋白包被并接种有不同浓度睾丸支持细胞过的6-孔培养板，先用只含有15％胎牛血清的DMEM高糖培养液中培养24h，待EB贴壁后更换为含N2、纤维连接蛋白和bFGF因子的无血清的DMEM/F12培养液，继续诱导培养2-3d可形成上皮细胞、成纤维细胞样NPC。NPC经nestin免疫组化染色鉴定。 5.ESC向IPC分化各阶段细胞的MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和FAS-L分子检测:实验组（共培养组）、对照组（无支持细胞）的EB、NPC、 IPC分化阶段和睾丸支持细胞对照组细胞，分别用MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、Fas-L抗体处理后进行流式细胞仪(FCM)分析，检测各自分子的表达情况。 结果: 1.睾丸支持细胞培养24h后，贴壁生长，经低渗处理可去除生精细胞，3-4d后，呈多边形或不规则形，突起粗大。胞质内有小颗粒状物质。细胞核大而明显，位于胞体中央，有多个核仁。经HE染色、油红0染色确认为睾丸支持细胞。培养1周，其纯度达到90％以上。 2.用13.5d的孕小鼠胚胎制备出的原代MEF，在悬浮状态下呈圆形。培养24h后，大部分细胞贴壁，呈上皮细胞或成纤维细胞样，可混杂有少量其他细胞。传代纯化后的MEF形态为长梭形纤维细胞样，不含杂细胞。 3.ESC接种24h后可贴壁生长。3-4d形成致密圆形或椭圆形的ESC集落。 4.ESC脱离分化抑制因素后，悬浮培养4-5d可自发分化、增殖，形成团状的EB。EB在NPC诱导培养基中贴壁生长。继续诱导3-4d可形成了上皮样细胞的NPCs。再在IPC诱导培养基中诱导培养6d后可形成为胰岛样细胞团(ICCs)。 5.FCM分别检测EB、NPC和ICCs的MHC、FasL分子表达，结果显示，在在没有睾丸支持细胞的情况下，Fas-L分子表达随着培养时间的延长逐渐降低;MHC-Ⅰ分子、MHC-Ⅱ分子表达则呈上升趋势。当与每毫升104、105、106浓度的睾丸支持细胞共培养时，不同分化阶段细胞的Fas-L、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子表达均呈逐渐降低趋势。 6.在预先有睾丸支持细胞贴壁生长的基础上接种EB，贴壁良好，不易脱落，不需要Ⅰ型胶原蛋白处理。 结论: 1.本实验采用睾丸支持细胞和EB共培养诱导分化的方法，在18d左右的时间内可获得具有胰岛样结构的IPC，可见睾丸支持细胞不影响其诱导过程 2.在没有睾丸支持细胞共培养的条件下，EB、NPC和ICCs的免疫原性是逐渐升高的。当有睾丸支持细胞共培养时，其相应分化阶段细胞的免疫原性逐渐降低。 3.在与睾丸支持细胞共培养时，支持细胞的存在有利于与EB的贴壁，未对EB向IPC分化形成不利影响。