【摘 要】
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甲状旁腺激素(parathyroid hormone)是保持体内血钙及磷酸盐平衡的主要调节因子,由甲状旁腺的主细胞产生,其主要的靶器官是骨骼、小肠和肾脏。临床上用于治疗骨骼类疾病,如:
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甲状旁腺激素(parathyroid hormone)是保持体内血钙及磷酸盐平衡的主要调节因子,由甲状旁腺的主细胞产生,其主要的靶器官是骨骼、小肠和肾脏。临床上用于治疗骨骼类疾病,如:低甲状腺血症、骨质疏松症等。采用基因工程的方法生产PTH是低成本获得髙质量产品的一种途径,已有研究探索了通过在大肠杆菌中表达hPTH蛋白的技术,但在真核细胞中获取hPTH的研究则尚少见报道。毕赤酵母(Pichia pastoris)是表达外源蛋白理想的真核表达系统之一,具有严格调控外源蛋白的表达、加工修饰表达产物、表达量高、营养要求低等优点。本研究旨在构建hPTH的酵母表达体系以获得更接近人体生理活性的真核表达产品,同时开展表达条件优化以摸索发酵生产的条件。实验中采用PCR方法扩增出hPTH基因,用限制性内切酶SnaBⅠ和NotⅠ双酶切hPTH基因和载体pPIC9K,回收纯化后以T4连接酶连接,构建表达载体pPIC9K-hPTH。经限制性内切酶SacI线性化后,用电转化的方法将表达质粒pPIC9K-hPTH导入毕赤酵母GS115。转化株通过G418筛选、MM-MD平板筛选和菌落PCR鉴定,获得了含有目的基因的阳性重组菌株,命名为GS115/pPIC9K-hPTH。将重组菌株在含1%甲醇的BMMY中进行诱导表达,通过SDS-PAGE法对表达产物进行分析,结果表明,hPTH基因在毕赤酵母中成功获得表达,表达蛋白的分子量约9.5KD。在摇瓶培养条件下,初步优化了甲醇诱导时间、甲醇诱导浓度、蛋白酶抑制剂EDTA等对hPTH蛋白表达有影响的条件。SDS-PAGE分析结果表明,在EDTA终浓度10mM、1.0%甲醇诱导96小时时重组菌株目的蛋白表达量较高。
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