卤醇脱卤酶的分子改造及在不对称合成手性环氧氯丙烷中的应用

• 作 者: 邓涵中
• 出 处: 浙江工业大学
• 发表日期: 2020年02期
• 关键词: 卤醇脱卤酶 手性环氧氯丙烷 分子改造 不对称催化

手性环氧氯丙烷（Epichlorohydrin,ECH）是一种手性三碳合成子,广泛应用于手性医药、化工制造和高端材料等领域。卤醇脱卤酶（Halohydrin dehalogenases,HHDHs,EC 4.5.1.X）可催化前手性1,3-二氯-2-丙醇（1,3-dicholro-2-propanol,1,3-DCP）不对称脱卤制备手性ECH,具有较大的应用潜力。但是,该工艺中逆反应的存在导致产物稳定性差、光学纯度低等问题,严重限制了其工业化应用。本论文开展卤醇脱卤酶的分子改造与光学纯（S）-ECH的生物合成工作,主要包括以下内容:以实验室前期构建的卤醇脱卤酶HheC（P175S/W249P）(HheC_PS)为模板,对其内部卤素离子通道和底物构象作用关键位点进行探究,应用定点饱和突变、迭代饱和突变等手段进行分子改造,获得高立体选择性卤醇脱卤酶突变体HheC_PS I81W、HheC_PS E85P、HheC_PS F86N和HheC_PS V94R,用于高光学纯度（S）-ECH的生物合成,催化活性分别为HheC_PS的34.65%、69.15%、39.78%以及25.43%。对HheC_PS及突变体进行重组表达、分离纯化与动力学参数研究。HheC_PSS I81W、HheC_PS E85P、HheC_PS F86N和HheC_PS V94R的正反应米氏常数(K_{m（1,3-DCP）})分别由20.83 mM降至19.35 mM、20.72 mM、16.87 mM以及15.84 mM。HheC_PSS I81W、HheC_PS E85P、HheC_PS F86N和HheC_PS V94R的催化效率(k_{cat（1,3-DCP）}/K_{m（1,3-DCP）})分别为0.73 mM^-1s^-1、0.71 mM^-1s^-1、0.64 mM^-1s^-1和0.32mM^-1s^-1,分别为HheC_PS的0.88倍、0.85倍、0.77倍以及0.36倍。HheC_PS I81W、HheC_PS E85P、HheC_PS F86N和HheC_PS V94R的逆反应米氏常数(K_{m（（S）-ECH）})由1.38 mM分别提高至4.01 mM、6.14 mM、7.31 mM以及6.75 mM,为HheC_PS的2.91倍、4.45倍、5.30倍和4.89倍,催化效率(k_{cat（（S）-ECH）}/K_{m（（S）-ECH）})由0.13mM^-1s^-1分别降至0.05 mM^-1s^-1、0.03 mM^-1s^-1、0.03 mM^-1s^-1和0.03 mM^-1s^-1,分别为HheC_PS的0.38倍、0.23倍、0.23倍以及0.23倍。各突变体不对称合成（S）-ECH反应的逆反应动力学过程抑制程度明显大于正反应,产物（S）-ECH的光学纯度大幅提升。应用HheC_PS I81W、HheC_PS E85P、HheC_PS F86N和HheC_PS V94R催化1,3-DCP不对称合成高光学纯度（S）-ECH。在37^oC,20 mM的1,3-DCP反应条件下,四株突变体首次制备得到对映体过量值（e.e.）>99.99%的（S）-ECH,产率分别为63.45%、69.15%、67.58%和57.50%。通过同源建模与分子对接揭示卤醇脱卤酶的立体选择性催化机制。第81位、第86位和第94位氨基酸残基通过影响卤素离子通道的形成,第85位氨基酸残基通过影响底物口袋中（S）-ECH的构象,调节酶的正、逆反应动力学过程,进而提高酶的立体选择性,实现了光学纯（S）-ECH的生物合成。