论文部分内容阅读
大豆疫霉(Phytophthorasojae)作为十分重要的植物病原卵菌之一，在大豆生产中引起毁灭性的病害——大豆疫霉根腐病。大豆疫霉无性生活史阶段产生孢子囊，释放游动孢子。在田间传播过程中，游动孢子识别寄主分泌的化学信号，定向游动定殖完成对寄主植物的侵染。因此，了解大豆疫霉游动孢子趋化性的分子调控机制，可以为有效的病害防控策略提供新的思路及方向。 大豆疫霉G蛋白α亚基互作蛋白的筛选。实验室前期研究发现，大豆疫霉G蛋白α亚基能够调控游动孢子对大豆根部释放的异黄酮的趋化性，揭示了G蛋白信号途径在大豆疫霉孢子囊形成和游动孢子行为方面具有一定的作用。为了了解大豆疫霉G蛋白α亚基通过调控哪些基因从而在G蛋白信号途径中起作用，我们利用酵母双杂交技术在大豆疫霉cDNA文库中筛选Gα亚基的互作蛋白。通过多次实验并对结果的初步验证，我们筛选得到了一个能够与Gα互作的激活态蛋白激酶C受体(ReceptorofActivatedProteinKinaseC)。通过序列比对分析，该蛋白的同源基因为拟南芥中的AtRACK1，因此我们将该基因命名为PsRACK1。 PsRACK1与Gα亚基一对一互作验证。在G蛋白信号途径中，Gα亚基存在激活与非激活两种不同形态。报道证明将非激活态Gα亚基R117位和Q203位的保守氨基酸精氨酸和谷氨酰胺替换为组氨酸和亮氨酸，可以破坏Gα亚基的GTP酶活性将其锁定在与GTP结合的激活状态。为了验证PsRACK1是否与两种形态的Gα蛋白均能够互作，我们分别用酵母双杂交和GSTPull-down体外互作验证技术对PsRACK1与PsGPA1和PsGPA1(R177H,Q203L)进行互作验证。两种实验技术所得结果均表明:PsRACK1能够与非激活态的PsGPA1直接互作，而与激活态的PsGPA1(R177H，Q203L)不能直接互作。 大豆疲霉PsRACK1功能研究。为了了解PsRACK1在大豆疫霉中的功能，本文采用PEG介导的原生质体转化方法对PsRACK1进行沉默，得到两个沉默转化子。对PsRACK1沉默突变体营养生长、有性生殖、对胁迫因子的耐受性和致病力变化等方面表型进行一系列测定后发现，沉默突变体卵孢子产量较野生型显著下降，推测PsRACK1调控大豆疫霉有性生殖。