论文部分内容阅读
目的：本研究旨在论证活性氧自由基是否参与肝卵圆细胞的恶性转化过程,初步探讨活性氧自由基在肝卵圆细胞异常分化、增殖中的作用及其机制,并探讨槲寄生总碱和槲寄生多糖清除氧自由基、调控肝卵圆细胞增殖和分化的作用和机制。
方法：体外培养大鼠肝卵圆细胞系WB-F344(简称WB细胞),分为完全培养基组,不完全培养基组和过氧化氢刺激组。其中过氧化氢刺激组是以小剂量7×10-7MH2O2作用于无血清培养条件下的WB细胞,通过MTT比色实验,观察其对细胞的增殖效应；以此小剂量每天作用一次,经21次连续作用后,观察细胞形态学变化、甲基纤维素半固体培养,结合流式细胞技术分析细胞周期及非整倍体细胞比例的变化,Westernblot方法检测甲胎蛋白(AFP)的表达,并以台盼蓝排斥实验鉴定细胞存活率作为质控等多种指标验证细胞恶性转化是否成功。在成功建立模型的基础上,采用槲寄生多糖、总碱对已经发生恶性转化的细胞实施干预。通过MTT比色实验测定槲寄生多糖、总碱对恶性细胞增殖的影响,结合台盼蓝染色以确定药物干预的浓度和时间。采用流式细胞技术分析药物干预后细胞周期的移行变化、DCFH-DA探针检测细胞内ROS含量的变化；采用羟自由基测定试剂盒检测药物干预后细胞培养上清液中羟基自由基的含量；Western blot方法检测各组细胞中甲胎蛋白(AFP)、G1期相关蛋白p-P53,P21,cyclinE的表达以及DNA损伤修复酶8-羟基脱氧鸟苷DNA糖苷酶(OGG1)的变化。
结果： MTT实验结果显示,剂量为7×10-7M H2O2作用12h对WB细胞产生的是增殖效应,结合台盼蓝染色发现细胞存活率达90％。以此剂量的H2O2刺激WB细胞21天后,发现刺激后的细胞形态不规则,核分裂相明显,接触抑制消失,常伴有重叠生长的现象；在甲基纤维素半固体培养过程中能形成明显的克隆；细胞周期的表现为:刺激组细胞G1期细胞比例与完全培养基组细胞相比明显减少,而S期细胞比例升高,伴有非整倍体细胞比例升高(P<0.05),并且刺激后的细胞内ROS水平升高(P<0.05)；Western blot结果显示,AFP表达升高(P<0.05),DNA损伤修复的关键酶OGG1含量降低(P<0.05)。以上指标均提示恶性转化细胞模型建立成功。药物干预MTT的结果显示:槲寄生多糖、总碱能较好的抑制细胞的增殖,呈现时间-剂量依赖性,以台盼蓝排斥实验作为质控,发现在槲寄生多糖5 g/L,总碱12 g/L处理72h后,细胞存活率仍达80％；细胞周期表现为干预后G1期细胞比例升高(P<0.05)；细胞内ROS降低(P<0.05)；细胞上清中抑制羟自由基产生的能力升高(P<0.05)；Western blot结果显示,药物干预后AFP表达水平下降(P<0.05)；p-P53(P<0.05),P21水平上升(P<0.05)；cyclin E(P<0.05)水平下降,而OGG1的表达没有明显的变化。
结论：肝卵圆细胞分化、增殖受所处微环境的影响,小剂量过氧化氢长期刺激WB细胞,可使细胞内ROS水平升高,引起细胞周期相关蛋白及DNA损伤、修复酶类的表达异常,导致卵圆细胞恶性转化,说明活性氧自由基参与了肝卵圆细胞增殖和分化过程的调控,是卵圆细胞恶性转化、异常增殖的重要原因之一；槲寄生多糖和总碱能显著抑制恶性转化细胞的增殖,并诱导卵圆细胞由幼稚向成熟分化,其可能机制是通过清除了细胞生存环境中的活性氧自由基,进而减少细胞内ROS水平,调控细胞周期,最终影响肝卵圆细胞的增殖和分化。