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纤维素酶是一种常见的生物降解酶,能够破坏β-1,4葡萄糖甘键,将纤维素降解为葡萄糖。在畜牧养殖方面,畜禽体内微生物对纤维素的消化吸收效果很那达到养殖者的要求,但是纤维素降解后的产物对畜禽的身体发育却能够产生积极的效果。为了追求纤维素在畜禽生产中的高利用率,本试验构建一株能够降解纤维素的重组菌,对扩大饲料原料来源具有参考意义。本试验选取纤维素酶CelKg基因为目的基因,以野生型枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis,B.subtilis)LN基因组中M1、M2为同源片段,以启动子P43基因作为启动子构建整合载体,将其转入野生型B.subtilis LN中,以期获得能够高效表达纤维素酶的重组菌,并对其进行酶活性分析。主要研究如下:选择质粒pGEM-T Easy为载体,利用T4连接酶将纤维素酶Cel Kg基因、启动子P43基因和同源片段M1、M2连接在一起构建重组质粒pGEM-Kmpgmt,将其转化后,通过蓝白斑筛选、聚合酶链式反应(PCR)验证,双酶切验证挑选重组大肠杆菌Kpg。在野生型B.subtilis LN感受态细胞的制备过程中,分别添加体积比为1%、2%、3%、4%和5%的吐温-80、甲醇和丙酮,统计感受态细胞的复活菌数。将外源质粒pGEM-kmpgt通过化学转化的方式转入制备好的B.subtilis感受态细胞中,以P4326F/P4326R为引物,利用PCR验证转化结果,并计算转化效率。试验结果显示,在野生型B.subtilis LN感受态细胞的制备过程中添加4%的甲醇,所制备的感受态细胞复活数最多为546个/μL,经转化后最多可获得52个转化子/μg,转化效率最高。利用spizizen转化法,将重组质粒pGEM-Kmpgmt转入野生型B.subtilis LN感受态细胞,以双交换的形式将纤维素酶基因CelKg转移至野生型B.subtilis LN基因组中,通过PCR验证目的片段成功整合到野生型B.subtilis LN中,获得重组菌B.subtilis Kpg。刚果红染色结果显示重组菌对羧甲基纤维素钠有降解作用。通过对重组菌菌落和菌液的观察,符合B.subtilis菌落和菌液的形态特征。在1000×倍的显微镜下观察重组菌,菌体呈杆状,均有芽孢出现,和野生型B.subtilis LN形态相同。对重组菌B.subtilis Kpg的最适培养时间、其表达的纤维素酶的最佳反应温度和最佳反应环境进行分析,结果显示重组菌B.subtilis Kpg在37℃条件下摇瓶培养,生长至18 h时上清液中纤维素酶活力最大为55.22 U/mL,与野生型B.subtilis LN相比提高了115%。B.subtilis Kpg纤维素酶的最适反应温度为60℃,此时纤维素酶活性最大为108.45 U/mL,反应液pH值为6时,纤维素酶活性达到97.72 U/mL。将重组菌B.subtilis Kpg添加到麸皮中进行发酵,测定其表达的纤维素酶对纤维素的实际降解能力。研究结果发现重组菌B.subtilis Kpg能够显著降低麸皮中的纤维素含量,同时发现重组菌B.subtilis Kpg和野生型B.subtilis LN均能将无机氮转化为真蛋白,增加麸皮中的真蛋白量。通过对重组菌B.subtilis Kpg的酶学性质研究和对发酵麸皮含量的分析,初步确定了重组菌B.subtilis Kpg对纤维素的降解能力,以及在发酵麸皮的利用价值,为B.subtilis工程菌的构建和实际应用提供部分的理论支撑。