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糖类物质是自然界分布最广泛、含量最丰富的有机分子,它与蛋白质、核酸、脂类并称为生命体的四大基本物质,并作为重要的生物信息分子参与到很多生命活动中起着至关重要的作用,要详细了解糖的生物学功能首先要对其结构进行精确解析。然而,由于糖链结构的复杂性、非模板合成、微不均一性以及分析手段的局限性,糖链的结构解析一直是一个世界性难题。随着科学技术的发展和分析手段的进步,已开发出多种方法用于糖链的分析研究,其中,用含有紫外或荧光基团的衍生试剂对糖链结构进行修饰、使之适用于高灵敏度的高效液相色谱和质谱分析的方法使用最为广泛。目前已开发出来的糖链衍生试剂有很多种,但是都存在种种不足,如使用氰基硼氢化钠等还原剂、操作复杂、衍生试剂难以去除对检测造成很大干扰等,因此开发新的、能够克服这些缺点的衍生试剂具有重要意义。本文重点开发研究了一种新的糖柱前衍生化方法,首次使用本身无荧光性的1,3-二(2-吡啶)-1,3-丙烷二酮(DPPD)作为糖的荧光衍生试剂,建立了糖柱前衍生化的高效液相色谱-电喷雾质谱分析方法。具体研究内容和结果如下:1.D-半乳糖DPPD荧光衍生产物的合成与表征以D-半乳糖为模型进行DPPD衍生,利用高效液相色谱仪、电喷雾质谱仪、核磁共振仪和荧光光谱仪对其衍生产物进行结构表征和荧光性质研究。其衍生原理如下:在NaHCO3甲醇-H2O体系中,DPPD的活性亚甲基与D-半乳糖还原端的半缩醛基经Knoevenagel缩合反应生成中间产物碳苷酮,该中间产物的酮羰基再与糖环C2位置上的羟基经关环反应生成半缩醛,进一步脱水生成具有吡啶环和吡喃环结构的荧光衍生产物。该荧光产物的质荷比为226.1[M+H]+。荧光光谱仪测得该荧光产物的最大激发波长是335 nm,最大吸收波长是381 nm。高效液相色谱分析表明,该荧光产物的最低检测限和最低定量限分别是625 amol和3.125 fmol。2.DPPD柱前衍生糖类物质新方法的建立探讨了各种衍生条件对衍生化反应的影响,并与其它常用的衍生化方法进行比较。该衍生化反应的最佳条件如下:DPPD的浓度为0.1 mol/L,反应温度为110℃,反应溶剂体系为甲醇/水(3:1,v/v),碳酸氢钠与D-半乳糖的摩尔比为8:1。与其它衍生方法,如2-AA、PMP相比,该方法具有不需使用氰基硼氢化钠等还原剂、灵敏度高、操作简便、HPLC分析不受衍生试剂干扰等优点。3.DPPD柱前衍生方法的考察用DPPD将D-半乳糖、D-葡萄糖和D-核糖三种标准品进行柱前衍生,考察此衍生化方法的稳定性、进样精密度、线性关系等指标。该方法得到的衍生产物稳定,存储3天的样品的相对标准偏差(RSD)<3%;进样精密度的相对标准偏差(RSD)<3%;线性关系良好;用DPPD对D-半乳糖、D-古洛糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、D-芹菜糖、D-木糖、L-岩藻糖和L-鼠李糖这8种单糖标准品进行衍生,其产物在10 min内可以得到分离,它们的保留时间分别是3.74 min、3.89 min、4.01 min、4.14 min、4.26 min、4.56 min、4.99 min、5.24 min。4.DPPD衍生法分析单糖组分用DPPD对生物样品如人血浆葡萄糖、酸水解后的人乳和牛乳游离糖以及酸水解后的辣根过氧化物酶进行柱前衍生,并与相应的单糖标准品相比较,探讨其单糖组分分析能力。采用该方法,可检测到50 nL的血浆样品中的葡萄糖;检测到酸水解后的牛乳中游离糖主要含有D-葡萄糖、D-半乳糖,而人乳游离糖中含有D-葡萄糖、D-半乳糖和L-岩藻糖;酸水解后的糖蛋白辣根过氧化物酶(HRP)中含有D-甘露糖、D-木糖、L-岩藻糖和D-阿拉伯糖。该方法可分析微量和较复杂的样品的单糖组分。5.DPPD衍生法分析寡糖利用DPPD对不同聚合度的中性寡糖如乳糖和麦芽五糖进行柱前衍生,并对其衍生产物进行高效液相色谱-电喷雾质谱分析。乳糖和麦芽五糖在高效液相色谱上的保留时间分别是10.72 min,12.01 min。该方法可用于寡糖的柱前衍生,其衍生原理与单糖衍生原理一致。利用DPPD柱前衍生法对乳中的三对同分异构寡糖(LNT和LNnT,LNFPⅠ和LNFPⅡ,LNDFHⅠ和LNDFHⅡ)以及用唾液酸转移酶PdST6合成的唾液酸寡糖进行分析,比较其荧光产物在C18反相色谱柱和亲水相互作用色谱柱(HILIC)上的分离情况。乳中的同分异构寡糖,用DPPD衍生后都能通过普通的C18反相柱或HILIC色谱柱进行分离分析,在C18反相高效液相色谱分离模式下, 其洗脱顺序是LNDFHⅡ、LNDFHⅠ、LNFPⅡ、LNFPⅠ、LNnT、LNT,即聚合度高的寡糖先被洗脱,聚合度低的后被洗脱,在HILIC模式下,洗脱顺序正好相反;DPPD衍生的乳寡糖经HILIC色谱柱分析时,其色谱峰较C18反相色谱柱尖锐。DPPD衍生的乳糖可以作为唾液酸转移酶PdST6的糖基受体,用于检测该酶的活性。综上,本研究建立的基于1,3-二(2-吡啶)-1,3-丙烷二酮(DPPD)的糖荧光衍生方法可用于单糖和寡糖的分析,并且该方法具有不需使用氰基硼氢化钠等还原剂,反应结束后不需纯化样品的优点,将为糖的色谱分离和结构分析提供新的选择。