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11β-羟基类固醇脱氢酶1(11β-HSD1)催化有生物活性的11β-羟基糖皮质激素和无活性的11酮基类固醇之间的转换。它的催化方向是由NADP+/NADPH的比例决定的。在肝细胞内，11β-HSD1主要表现为还原酶活性，但在睾丸间质细胞内，它却主要表现为氧化酶活性。然而，11β-HSD1催化方向在两种细胞中不同表现的具体机制还不明确。有人提出11β-HSD1的方向性是由己糖-6-磷酸脱氢酶(H6PDH)调节的，己糖-6-磷酸脱氢酶(H6PDH)催化葡萄糖-6-磷酸(G6P)产生NADPH从而促进11β-HSD1成还原酶。在肝细胞内，11β-HSD1和H6PDH的催化作用如下图示。 实验目的:研究大鼠及人体内11β-HSD1和H6PDH之间的耦联关系。 实验方法:购买36只90天龄的雄性SD大鼠，每组6只，共分为6组。30只大鼠腹腔内注射75 mg/Kg的二甲磺酸乙烷（EDS，一种能够特异性地去除成年大鼠睾丸间质细胞的化合物）。其它6只大鼠注射等体积的溶媒(1∶4，v/v，DMSO/水)，1h后处死作为对照组。处理组大鼠注射EDS后4，7，14，35和90天处死。每组每只大鼠都取一个睾丸，用针在睾丸上刺3个或者更多个孔，并将其浸泡于Bouin液中4℃过夜，然后储存于4℃的70％酒精中，直至下一步免疫组化处理。每只大鼠的对侧睾丸冷冻在液氮中以进行核酸分析。1）实时定量PCR(Q-PCR):用核糖体蛋白S16(Rps16)作为内标，测定Hsd11b1、H6pd、Slc37a4等基因的表达水平;2）免疫组织化学染色:对睾丸切片进行免疫组化染色反映11b-HSD1的组织定位和表达量;3）蛋白印迹法:检测微粒体中11β-HSD1的表达量和完整性;4）提取纯化的睾丸间质细胞和肝实质细胞，同时制备微粒体蛋白。采用放射薄层层析法检测11β-HSD1的氧化和还原活性。分光光度法检测NADPH的活性以及测定NADP+和NADPH的含量;5）应用统计软件Graphpad对数据进行统计分析，数据以平均值±标准误表示，且数据用单因素方差分析进行分析。 实验结果:研究发现，当大鼠睾丸间质细胞消失后，Hsd11b1 mRNAs的水平几乎降到零，而当大鼠睾丸间质细胞再生后，Hsd11b1 mRNAs水平上升。当大鼠睾丸间质细胞完全消失后，H6pd和Slc37a4 mRNAs的表达水平没有发生任何改变。说明H6pd和Slc37a4 mRNAs不是来自大鼠睾丸间质细胞，因为大鼠睾丸间质细胞的消除并没有影响它们的表达。在大鼠完整的肝细胞中，11β-HSD1还原酶的活性是氧化酶活性的3倍，在完整的大鼠睾丸间质细胞中，11β-HSD1的氧化酶活性则明显强于还原酶活性。在完整的大鼠肝细胞内，S3483（一种抑制G6P转运的化合物）的使用明显增加了11β-HSD1的氧化活性降低了其还原活性。而在完整的大鼠睾丸间质细胞中S3483对11β-HSD1的氧化活性和还原活性都没有影响。G6P浓度依赖的增加了大鼠肝微粒体11β-HSD1还原酶的活性，但对大鼠睾丸间质细胞的11β-HSD1还原酶活性几乎没有影响。G6P增加了人肝微粒体中的11b-HSD1还原酶活性，S3483可以逆转G6P的这种促进作用。人睾丸微粒体中的11β-HSD1还原酶活性和大鼠睾丸间质细胞微粒体中的一样，G6P对其没有刺激作用，S3483对其也没有影响。 实验结论:在大鼠（3倍）或者人（1.5倍）的肝脏微粒体中G6P促进11β-HSD1的还原酶活性，但是在睾丸中却没有这种作用。S3483可以逆转G6P介导增加的11β-HSD1还原酶活性。使用睾丸间质细胞毒物EDS，其选择性耗尽睾丸间质细胞。睾丸间质细胞的耗损会消除Hsd11b1（编码11β-HSD1）的表达，但是不影响H6pd(编码H6PDH)和Slc37a4（编码G6P转运体）的表达。在纯化的大鼠睾丸间质细胞内，H6pd mRNA水平和H6PDH的活性几乎测不到。H6PDH的可用性决定着11β-HSD1在肝内和睾丸间质细胞内的不同方向。