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本文主要从以下几方面进行论述： 第一部分 携带MBD1短发夹RNA慢病毒载体的构建及筛选 目的：携带MBD1短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒载体的构建；筛选有效MBD1shRNA片段。 方法：（1）设计4对MBD shRNA片段（1#、2#、3#、4#shMBD1）和Scramble（无意义）shRNA片段后，进行质粒重组、慢病毒载体的构建、转染、病毒液收集及病毒滴度的测定等；（2）培养P19细胞，然后将慢病毒载体感染到P19细胞中，给予嘌呤霉素筛选；（3）利用荧光显微镜、qPCR和Western blotting筛选出对P19细胞MBD1敲减效率高的慢病毒载体。 结果：（1）利用荧光显微镜观察P19细胞感染慢病毒72h后绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达情况，使用嘌呤霉素筛选后的四个重组shMBD1慢病毒载体感染效率均在95%以上。（2）qPCR结果显示，Scramble组与对照组相比，无显著性差异（P＞0.05），表明慢病毒本身对细胞MBD1mRNA水平无明显影响；#1、#2、#3、#4组与Scramble组相比，MBD1mRNA水平均下降，差异具有显著性（P＜0.01），其中#1、#2慢病毒的敲减效果更明显，敲减率可达（88.54%，88.51%各自的）。Western blotting进一步证明#1、#2、#3、#4慢病毒均使P19细胞的MBD1蛋白表达水平下降（P＜0.01），其中#2慢病毒对P19细胞MBD1蛋白表达的抑制作用可达71.54%。 结论：#1、#2、#3、#4重组MBD1shRNA慢病毒载体，都能有效降低MBD1mRNA和蛋白表达水平，其中#2重组慢病毒对MBD1基因抑制效果最好。 第二部分 MBD1对P19细胞细胞周期的影响及机制研究 目的：从细胞和分子水平上研究MBD1对P19细胞细胞周期的影响及作用机制。 方法：（1）培养已转染2#慢病毒载体的P19细胞，用流式细胞仪检测敲减MBD1对P19细胞细胞周期的影响，同时利用qPCR和Western blotting检测p53、p21、PTEN以及Gadd45αmRNA和蛋白表达水平。（2）用MTT法检测给予不同浓度（5、10、20、40和80μmol/L）的p53特异性抑制剂（PFT-α）在24h、48h、72h对P19细胞的抑制率，筛选出最佳的PFT-α浓度，并利用q PCR和Western blotting筛选出最佳的作用时间。培养PFT-α处理的P19细胞，然后用流式细胞仪检测p53抑制后细胞周期的变化，并利用qPCR和Western blotting检测p53、p21、PTEN以及Gadd45αmRNA和蛋白表达水平。（3）培养已转染2#慢病毒载体的P19细胞，给予PFT-α，用流式细胞仪测定抑制p53后细胞周期的变化，同时使用qPCR和Western blotting检测p53、p21、PTEN以及Gadd45αmRNA和蛋白表达水平。 结果：（1）流式细胞仪结果显示，Scramble组与对照组相比，细胞G0/G1期增加，G2/M期减少，表明慢病毒本身会对P19细胞细胞周期产生一定影响，但无统计学意义（P＞0.05）。shMBD1组与Scramble组相比，S期明显增加（P＜0.01），表明缺失MBD1细胞周期阻滞在S期。qPCR结果显示，Scramble组与对照组相比，p53、p21、PTEN及Gadd45αmRNA水平没有明显差异；shMBD1组与Scramble组相比，p53、p21及Gadd45αmRNA水平增加（P＜0.01），PTEN mRNA水平下降（P＜0.05）；Western blotting结果显示，Scramble组与对照组相比，p53、p21、PTEN及Gadd45α的蛋白表达水平没有明显差异；shMBD1组与Scramble组相比，p53、p21及Gadd45α蛋白表达水平增加（P＜0.05），PTEN蛋白表达水平没有明显变化（P＞0.05）。（2）MTT法检测显示PFT-α以20μmol/L作用48h时，细胞抑制率在50%左右；给予P19细胞20μmol/L PFT-α，利用qPCR和Western blotting检测p53mRNA及蛋白表达水平，结果显示24h、48h、72h时间点P19细胞的p53mRNA和蛋白表达水平均下降，且具有时间依赖性（P＜0.01）。流氏细胞仪结果显示，给与PFT-α后，P19细胞在G0/G1期细胞显著增加，S期和G2/M期减少（P＜0.05），表明细胞停滞在G0/G1期。qPCR结果显示，PFT-α组与对照组相比，p53、p21及Gadd45αmRNA的水平均下降（P＜0.01），PTEN mRNA水平增加（P＜0.01）；Western blotting结果显示，PFT-α组与对照组相比，p53蛋白表达水平降低（P＜0.05），PTEN蛋白表达增加（P＜0.01），p21及Gadd45α蛋白表达差异不显著（P＞0.05），表明PFT-α能效抑制p53蛋白表达。（3）shMBD1+PFT-α组与Scramble组相比，细胞G0/G1期增加，S期减少，G2/M期增加（P＜0.01），表明细胞停滞在G0/G1期和G2/M期。qPCR结果显示，shMBD1+PFT-α组与Scramble组相比，p53mRNA水平降低（P＜0.01），p21、PTEN以及Gadd45αmRNA水平增加（P＜0.01）。Western blotting结果显示，shMBD1+PFT-α组与Scramble组相比，p53蛋白表达水平降低（P＜0.01），p21、PTEN以及Gadd45α蛋白表达均增加（P＜0.01）。 结论：敲减MBD1可使P19细胞阻滞在S期，其机制是p53依赖性的，可能通过p53/PTEN信号通路；MBD1通过抑制p53、p21、Gadd45α的基因转录，调控这些基因的mRNA和蛋白表达水平。