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酒精滥用和酒精依赖已成为当今世界上日益严重的公共卫生问题,特别是青少年饮酒更值得人们重视。肝脏是酒精吸收后的主要代谢场所,也是毒害的主要靶器官。乙醇对肝细胞的损伤,涉及多种机制,但氧化损伤是其共同的早期改变,主要表现为:活性氧(ROS)大量产生,氧化-抗氧化系统失衡,脂质代谢紊乱,生物大分子氧化变性与加合物形成,最终导致细胞结构与功能的紊乱。姜黄素是一种天然的抗氧化物质,属于多酚类化合物,几乎无毒,其不仅在食品体系显出很强的抗氧化活性,而且在生物体内也显出较强的抗氧化性。最近,有学者发现它能抑制许多与过氧化相关的疾病,于是它在生物体内的抗氧化性引起人们的注目。其广泛的生物活性包括抗炎、抗氧化、抗诱变,降血脂及抗动脉粥样硬化,抗肿瘤(拮抗致癌过程中所造成的DNA损伤作用)等等。姜黄素不仅本身具有抗氧化活性,还能清除自由基,提高自由基清除剂含量和诱导抗氧化酶活性。姜黄素还是血红素氧化酶-1(HO-1)的天然诱导剂。在机体内源性抗氧化系统中,Ⅰ型血红素氧化酶(Heme Oxygenase-1,HO-1)因其应激性、可诱导性和对多种氧化损伤(如缺血、缺氧、高温、辐射及外源性化合物等引起)良好的保护效应,近年来备受关注,成为预防氧化攻击的首选靶基因之一。HO-1系统被认为具有抗氧化、维持微循环、调节细胞周期及抗炎等功能。Motterlini等人最近证实在内皮细胞和神经细胞中HO-1可以被caffeic acid phenethyl ester(CAPE)和姜黄素诱导,因此,我们可以假设这些天然物质具有抗氧化的功效可能与它们可以激活HO-1途径有关。最近的研究也证实在极度的低氧环境中,正是由于姜黄素可以诱导内皮细胞HO-1表达,因此帮助细胞抵御氧化应激。HO-1基因的诱导主要在转录水平被调节。已经确定的是,在HO-1基因启动子上游发现有多个抗氧化剂反应元件(antioxidant-response element,ARE),目前发现的ARE结合蛋白有Nrf2和MafK,前者在氧化剂刺激下激活,而后者正相反。Nrf2的活性通常在胞质中通过一种与伴侣蛋白Keap1结合而被抑制。但是,当拥有修饰巯醇基能力的亲电子基团或者化合物的不断积聚,Keap1对Nrf2活性的抑制就消失了,Nrf2易位进入核内,作用于ARE。基于以上分析,我们假设姜黄素通过Nrf2/ARE信号通路诱导HO-1表达,进而表现出对酒精性肝损伤的保护效应。研究目的:本项目拟以大鼠原代肝细胞为研究对象,以HO-1为靶点,观察姜黄素对细胞的抗氧化保护作用,研究姜黄素诱导HO-1与Nrf2活化的分子机制。研究方法:本实验以原代大鼠肝细胞为研究对象,用含不同浓度酒精的培养基培养,于不同时间收集细胞,用酶学方法检测细胞培养上清液中LDH,GOT水平。用酶学、生化学等方法检测细胞内MDA,GSH及SOD活性。观察酒精对肝细胞氧化损伤的时间剂量效应,建立大鼠肝细胞氧化损伤模型。观察姜黄素对酒精诱导的肝细胞氧化损伤的保护作用。根据前面实验的氧化损伤模型参数,在使用酒精染毒细胞前,用姜黄素预处理肝细胞,观察姜黄素对肝细胞保护的时间-剂量效应情况,测定指标同前,从而确定姜黄素对肝细胞氧化损伤的保护作用。为了证实HO-1/Nrf2途径在姜黄素抗氧化能力中的作用,使用HO-1经典诱导剂Hemin及抑制剂ZnPPⅨ作用肝细胞,梯度离心提取肝细胞微粒体,对比姜黄素组观察各组诱导HO-1活性的能力。在此基础上,使用westernblot方法检测姜黄素干预对肝细胞Nrf2蛋白表达影响,以及与MAPK各级联通路抑制剂共孵育后Nrf2蛋白表达水平的变化,研究姜黄素诱导HO-1与Nrf2活化的分子机制。研究结果:1、酒精对肝细胞的损伤程度与给予酒精的浓度以及作用时间呈正相关。随着酒精浓度的增加,肝细胞的活力逐渐降低,脂质过氧化程度不断加重,细胞内抗氧化酶水平不断下降,在100 mmol/L时,影响程度明显。随着酒精作用时间的延长,相对于正常对照组,细胞活力降低、脂质过氧化程度加重,细胞内抗氧化酶水平降低,在8 h时影响程度明显。2、姜黄素能降低酒精诱导的肝细胞氧化损伤。在乙醇作用前,预先给予姜黄素进行干预,可明显减轻酒精所致的GSH消耗、抗氧化酶失活和脂质过氧化,提高细胞的代谢活力,促使失衡的抗氧化系统尽快恢复,对细胞酒精性氧化损伤表现出较强的保护效应。3、姜黄素能够诱导HO-1发挥抗氧化作用。HO-1活性和表达与肝细胞的氧化抗氧化水平相关,抗氧化水平较好的15μmol/L预作用1 h时,HO-1活性最高。姜黄素能诱导HO-1的活性和表达,在15μmol/L和6 h时达到高峰。4、ERK信号通路抑制剂PD980059、P38信号通例抑制剂SB203580以及JNK信号抑制剂SP600125不能抑制姜黄素诱导Nrf2蛋白的表达;而加入PI3K信号通路抑制剂wortmannin和LY294002后,能阻止姜黄素诱导Nrf2蛋白表达。结论:姜黄素对肝细胞有明显的保护作用,能部分对抗酒精对肝细胞的氧化损害,其主要表现在:提高细胞的活性;减少细胞损伤;提高细胞内抗氧化酶水平,降低脂质过氧化程度;提高细胞HO-1活性及表达水平。HO-1在姜黄素发挥抗氧化作用中发挥重要作用,其作用机制与Nrf2途径有关。在细胞内传导通路中,PI3K是Nrf2易位至核内的主要方式。