朗德鹅C/EBP基因的克隆、表达及DNA甲基化分析

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本文采用同源克隆的方法,获得了朗德鹅C/EBPα和C/EBPβ基因的编码区全序列,利用生物信息学方法预测了蛋白的结构和功能,采用系统发育分析软件进行了同源序列多重比对和分子系统发育分析。利用实时荧光定量(Real-time) PCR技术分析了鹅C/EBPp基因的mRNA在不同组织的相对表达水平,同时检测了甜菜碱处理对朗德鹅肝脏C/EBPp基因mRNA表达水平和启动子甲基化的影响。主要研究结果如下:1C/EBPa和C/EBPp基因的克隆测序:本实验根据其他物种的C/EBPa和C/EBPp基因DNA序列设计引物扩增出朗德鹅C/EBPa基因1401bp的序列(GenBank登录号:EU502716), C/EBPα基因2130bp的序列(GenBank登录号:GU068582)2C/EBPα和C/EBPβ蛋白的生物信息学分析:借助生物信息学网络资源和软件,预测出鹅C/EBPα基因开放阅读框的长度为975bp,编码324个氨基酸残基,且两侧分别是210bp的5’UTR和397bp的3’UTR。通过对蛋白序列相似性检索,预测出鹅C/EBPα蛋白不含有信号肽,不含有跨膜区,定位于细胞核中,而且确定其含有亮氨酸拉链结构域。推测猪鹅C/EBPα蛋白具有DNA结合活性,参与基因转录调控。预测出C/EBPβ基因开放阅读框的长度为984bp,编码327个氨基酸残基。通过对蛋白序列相似性检索,预测出鹅C/EBPβ蛋白不含有信号肽,不含有跨膜区,定位于细胞核中,而且确定其含有亮氨酸拉链结构域。推测猪鹅C/EBPβ蛋白具有DNA结合活性,参与基因转录调控。3Real-time PCR分析C/EBPβ基因在组织中的相对表达:采用RT-PCR技术,分析了鹅C/EBPβ基因在不同组织中的相对表达水平,结果表明:C/EBPβ基因在鹅的各个组织均表达,但在肝脏、脂肪组织和肺脏表达量明显高于其它组织,因此推测C/EBPβ基因在鹅肝脏脂肪代谢过程具有重要作用。4Real-time PCR分析甜菜碱处理对朗德鹅肝脏C/EBPβ基因表达水平的影响:采用RT-PCR技术,检测了填饲过程中添加甜菜碱对朗德鹅肝脏中C/EBPp基因mRNA的表达水平的影响,结果显示,填饲可以极显著提高朗德鹅肝脏中C/EBPβ基因mRNA的表达水平(P<0.01),而填词的过程中添加甜菜碱可降低朗德鹅肝脏中C/EBPβ基因mRNA的表达水平(P<0.01)。5亚硫酸氢钠测序法检测不同处理对朗德鹅肝脏C/EBPβ基因启动子区甲基化水平的影响:对C/EBPβ基因启动子区域的54个CpG位点进行分析发现:对照组该区域1.48%的位点甲基化,而经过填饲处理后,有2.96%的位点甲基化;甜菜碱处理后有2.23%的位点甲基化。与填饲组相比,甲基化程度降低,但是没有达到显著水平。
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