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背景：霍乱是由霍乱弧菌引起的一种烈性肠道传染病。通过污染的水和食物传播，自1817年至今霍乱已发生7次全球性大流行，据世界卫生组织(WHO)报告，霍乱每年发生病例10万例，给人们生命健康及社会经济发展带来极大威胁。采用以分离培养为基础的传统检测方法工作量大，耗时长，对于一些含菌量低的标本，或处于VBNC状态的霍乱弧菌检出率低甚至不能检出。以核酸检测为基础的基因诊断方法，因为其对标本要求低，灵敏快速，正成为霍乱诊断研究领域的研究重点。方法：以霍乱弧菌毒素编码基因ctx和O抗原编码基因rfb作为靶基因，将ctx基因序列、O1群霍乱弧菌rfb基因簇序列和O139群霍乱弧菌rfb基因簇序列用blast工具在GeneBank中比对，寻找出特异保守的1rfb序列、9rfb序列、ctx序列，作为检测的标志序列。针对检测标志序列设计引物和探针，并构建1rfb、9rfb和ctx的克隆。对提取的质粒进行紫外定量，再倍比稀释，制成标准品。用标准品优化反应条件，建立三重taqman实时PCR检测体系。将霍乱疫苗定量倍比稀释后，接种至健康人的大便标本中，制成模拟的霍乱患者临床标本。以23种肠道菌作为阴性对照菌，以质粒标准品和模拟标本作为阳性样品，用以评价所建检测体系的灵敏度。结果：以质粒为检测对象，检测体系灵敏度可达10拷贝／反应体系。采用大便作为检测标本，检测体系灵敏度可达10CFU／g。对23种肠道菌进行多次重复试验，均没有扩增曲线出现，说明检测体系具有较好的特异性和敏感性，且整个反应可在3小时内全部完成。结论：本研究采用taqman探针技术建立霍乱弧菌三重实时PCR检测体系，检测灵敏度高，特异性好，速度快，一次反应可实现对霍乱弧菌定性、定量、分型以及毒性检测的目的，有望在临床检验、食品卫生、疾病控制和出入境检验等领域发挥重要的作用目的：以炭疽芽孢杆菌的主基因和致病毒素基因pagA特异性序列为检测标志，建立高敏感高特异的荧光双重实时TaqMan聚合酶链反应快速检测体系。方法：根据炭疽杆菌主基因组特异性序列(GS)和特异的毒力岛pagA基因序列(Pag)设计引物及探针，通过构建目的质粒获得标准模板，利用TaqMan标记探针和便携式Smancycle实时聚合酶链反应检测平台探讨该检测体系的检测敏感性和特异性。结果：该体系炭疽芽孢杆菌的检测敏感度为10~2拷贝每反应体系，检测其他蜡样杆菌群细菌未出现非特异性扩增，具有较高的特异性。整个反应在1h内完成，适合于实验室或野外环境下炭疽芽孢杆菌的快速检测。结论本研究建立的双重TaqMan实时聚合酶链反应检测体系可作为炭疽芽孢杆菌快速、准确、特异、敏感的检测手段。