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水通道蛋白(AQP)对水具有极高的渗透性,有可能在仿生废水回收以及海水淡化等领域具有潜在的重要应用价值。本论文的研究目标是对来源于深海嗜压菌Photobacterium profundum SS9的潜在水通道蛋白基因(aqpSS9)进行在多种异源表达体系中进行表达,并分析其可能的生物学功能。
首先利用生物信息学分析表明,AqpSS9肽链一级结构与大肠杆菌AqpZ的同源性高达67%,内含水通道蛋白的2个NPA保守序列,具有6个跨膜结构,从而具有强烈疏水特性,预测将整合在细胞膜上,有可能是一种新型的水通道蛋白。
采用PCR方法从P.profundum SS9细菌基因组扩增得到AqpSS9的编码基因,构建成功表达载体pUC19-AqpSS9和pSJ2-AqpSS9,转化大肠杆菌,形成大肠杆菌MM/pUC19-AqpSS9和MM/pSJ2-AqpSS9。然后将这二种基因工程菌与AqpZ-改造菌MM1211(aqpZ-)在低渗条件下分别进行混合培养,以观察重组菌与改造菌的生长竞争现象。实验发现重组菌对改造菌有极明显的生长竞争优势,两者菌量比值最高可达32倍,从而间接鉴定了AqpSS9具有一定的水透过功能。
进一步对AqpSS9在大肠杆菌中的表达条件进行优化。在优化了诱导条件(包括诱导时间、培养温度、IPTG浓度、诱导后培养时间)下,E.coli Rossetta(DE3)对AqpSS9的活性表达效率最高,AqpSS9表达量达48 mg/L。
最后,为有效避免AqpSS9因强烈疏水性而导致的细胞毒性,论文采用适合于细胞毒性蛋白表达的Bac-to-Bac家蚕杆状病毒真核表达系统开展AqpSS9表达的研究。首先构建了重组穿梭载体Bacmid-AqpSS9,转染家蚕BmN细胞,发病后获得重组家蚕多角体病毒rBmAqpSS9。经过数代扩增,收获并保存适宜滴度的病毒储液,按感染复数MOI为5感染BmN细胞,最终成功表达了AqpSS9,表达量高达130 mg/L。