论文部分内容阅读
家蚕作为重要的绢丝昆虫，经常受到各种蚕病的危害。家蚕核型多角体病是养蚕生产上最常见的、危害较严重的一类蚕病，属亚急性蚕病，影响着世界养蚕业的持续稳定的发展。目前越南蚕病研究工作开展较少，在核型多角体病毒分子诊断研究方面还是空白，因此开展针对越南蚕区危害较严重的家蚕核型多角体病的生物学研究，对推动越南蚕丝业的安全生产具有较重要的指导意义。 本论文首先采用实地调研和问卷等方式，调查了越南主要蚕区蚕病发生的概况；搜集分离、繁殖纯化了3株越南来源的核型多角体病毒，分别是来自北部河内市的BmNPV-Hn，和来自南部林同省的BmNPV-Lt以及来自河内蓖麻蚕核型多角体病毒(ArNPV-Hn)。应用光学显微镜(LM)、扫描电子显微镜(SEM)、透射电镜(TEM)等技术，观察比较了不同来源NPV病毒株与实验室保存的BmNPV-Gd株多角体表面形态和内部结构；同时对3株不同地理株的BmNPV和1株ArNPV进行了感染家蚕的毒力测定研究。此外还对3株病毒的polh基因及Bm126基因进行了PCR的检测和测序分析。研究结果如下： (1)越南蚕区蚕病的发生情况调查发现，不同地理位置蚕区发生蚕病的种类不同，且发病率也不同。以病毒病、细菌病危害最重。南方主要为白僵病(约占总发病率的15-30％)、蝇蛆病(15-25%)、血液型脓病(9-12%)。另外调查发现南方还发生了一种疑似细菌病的蚕病，这种病多发生在5～6月份，5龄第2～3日感病，身体逐渐缩小、软化死亡；北方主要发生的蚕病为病毒病(约占总发病率的5-32%)、细菌病(5-25%)，蝇蛆病只在太平省发生(2-15%)，微粒子病和白僵病很少发生。越南全年均有蚕病发生，蚕病多发季节为6～8月；但北方和南方蚕病发生的时间有差异，北方为蚕病发生时间为2-11月，南部为4月至来年的1月，以7月发病最为严重；且蚕品种不同，发病率也不一样，二化性蚕种相对较易发病。 (2)光学显微镜观察到的病原多角体均为六角形或圆形，不同病原之间很难区分；而在SEM下观察，核型多角体大部分是六角体，但是BmNPV-Gd株还观察到4角体、5角体以及球形；BmNPV-Hn株观察到4角体；ArNPV-Hn株多角体还发现个别特异锥形体。用透射电镜IEM观察NPV的内部超微结构，病毒粒子由病毒核酸与蛋白质的复合体组成，且都是单粒包埋形，多角体内病毒粒子排列紧密；BmNPV的多角体蛋白外壳均比ArNPV的厚。 (3)毒力比较发现BmNPV-Gd株、BmNPV-Lt株及ArNPV-Hn株LD50大小相近，BmNPV-Hn株的LD50弱些。它们的大小分别为6.2×106个/mL、6.6×106个/mL、7.2×106个/mL、6.2×105个/mL，典型发病时间为第5天。 (4)分别设计合成了针对BmNPV多角体病毒polh基因的引物Phy35/Phy36和针对BmNPV11k家族基因ORF126(Bm126)的引物Bm126RF/Bm126RR，对4株病毒基因组进行了PCR检测和测序分析。结果表明：两对引物分别扩增了约652bp和531bp的目的片段。通过系统进化树分析发现，BmNPV-Hn株与BmNPV-Lt株在polh和Bm126基因系统树里均聚在同一树枝，但BmNPV-GD株和蓖麻蚕核型多角体分离株ArNPV-Hn株则分别在不同的树枝上，这些数据说明不同来源的BmNPV既有地理上的差异，且不同寄主来源的NPV亦有一定的亲缘关系。 本研究首次深入比较分析了越南BmNPV与中国广东BmNPV的关系，并根据调查结果，结合越南蚕桑生产的实际，对越南核型多角体病的病原来源进行了探讨，并提出了具体的防控措施。