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目的:柯萨奇病毒属小RNA病毒科肠道病毒属,其中B组3型(Coxsackievirus group B type 3, CVB3)是引起柯萨奇病毒爆发性流行的最常见的血清型之一,其感染是导致急、慢性心肌炎和扩张性心肌病重要原因,因此对其防治手段的研究日益受到人们的重视。由于目前尚无特别有效的防治方法,所以研制CVB3疫苗成为预防该病毒感染的重要策略。DNA疫苗自90年代发展以来,在抗病毒免疫中具有诱导机体产生特异性体液免疫和细胞免疫应答的优势。国内外研究发现,编码CVB3主要衣壳蛋白VP1的DNA疫苗能够诱导小鼠产生体液和细胞免疫应答,并对感染小鼠具有一定的保护作用,但存在免疫原性差、免疫保护作用不能令人满意的问题。因此,增强VP1基因的免疫原性,提高CVB3特异性体液和细胞免疫应答,提高其免疫保护作用是本研究的主要设计思路。补体是天然免疫系统的重要组成部分,近年来的研究表明,补体裂解片段还可以触发和调节获得性免疫应答。补体片段C3d由补体蛋白C3活化裂解而来,是不能被蛋白酶裂解的最小片段。C3d的受体是II型补体受体(complement receptor type II, CR2),主要分布在成熟的B淋巴细胞和滤泡树突状细胞(follicular dendritic cells, FDCs)。C3d与抗原偶联后可通过特异性受体CR2将抗原信号提供给CR2+细胞,从而诱导特异性免疫应答。有研究表明,C3d与CR2结合可以为抗原与B细胞受体(B cell Ag-receptor,BCR)的交联提供共刺激信号,降低B细胞的活化阈值,促进抗体的亲和力成熟,调节B细胞与T细胞之间的相互作用,从而提高疫苗的免疫原性。鉴于C3d的分子佐剂作用,本研究将编码带有白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)信号肽的分泌型CVB3 VP1(secreted form of CVB3 VP1, sVP1)和三拷贝C3d基因拼接,将连接产物插入真核表达质粒pcDNA3,构建重组质粒pcDNA3/sVP1-C3d3,通过研究该疫苗免疫BALB/c小鼠后诱生的特异性免疫应答和病毒攻击后的免疫保护作用来探讨这种疫苗的应用效果。方法:(1)用合适的限制性内切酶对含有C3d3编码基因的质粒pSG5.C3d3.YL进行双酶切,经酶切鉴定确认C3d3片段正确。(2)以编码sVP1蛋白的DNA为模板,用自行设计的sVP1的特异性引物进行PCR扩增,将扩增产物与pGEM-T载体连接,转化DH5α大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定和测序筛选重组子。(3)经酶切鉴定和测序确认后,取双酶切的sVP1片段与经过同样两种酶酶切的pcDNA3载体连接,构建真核表达质粒pcDNA3/sVP1。(4)将C3d3从pSG5.C3d3.YL的BglII和XbalI位点之间切出,同时以BamHI和XbalI双酶切pcDNA3/sVP1,将C3d3插入pcDNA3/sVP1,构建真核表达重组质粒pcDNA3/sVP1-C3d3。(5)用碱裂解法从转化的DH5α大肠杆菌中大量提取质粒pcDNA3/sVP1、pcDNA3/sVP1-C3d3和pcDNA3,用聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)沉淀法进行纯化。(6)动物实验:将6～8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为3组,分别为pcDNA3对照组、pcDNA3/sVP1对照组和pcDNA3/sVP1-C3d3组,每组14只,纯化后的质粒以生理盐水稀释后,股四头肌注射免疫小鼠,每次每只接种100μg,每4周免疫1次,共免疫3次;每次免疫后第14天,眼眶静脉取血,分离血清,用微量中和试验(固定病毒-稀释血清法)检测血清中CVB3特异性中和抗体的水平;第3次免疫后3周,每组3只小鼠取脾脏制备淋巴细胞悬液,采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8, CCK-8)法进行特异性淋巴细胞增殖活性和特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)杀伤活性的检测;另每组8只小鼠用致死量的CVB3(5LD50)进行腹腔注射,观察并记录小鼠死亡情况至感染后第21天;每组剩余的3只小鼠用3LD50CVB3攻击,注射病毒后第7天处死,用于血中病毒滴度的测定,同时取不同处理组的心脏制备石蜡切片,HE染色,观察各组小鼠心肌病理学改变。结果:(1)以限制性内切酶双酶切从质粒中获得C3d3片段,PCR扩增出sVP1基因片段,采用DNA测序和双酶切证实这两段基因片段的长度均与报道的基因序列相一致。(2)成功构建真核表达质粒pcDNA3/sVP1-C3d3,双酶切结果证实插入和连接均正确。(3)三次免疫接种小鼠后,各组血清中和抗体的平均效价分别为:pcDNA3/sVP1组1:8.91,1:15.87,1:28.28;pcDNA3/sVP1-C3d3组1:8.41,1:25.19,1:33.65;pcDNA3组各次平均效价均低于1:5.00。单因素方差分析表明,三次免疫后,pcDNA3/sVP1组和pcDNA3/sVP1-C3d3组中和抗体滴度逐次增加( P<0.05 );第三次免疫后pcDNA3/sVP1-C3d3组中和抗体滴度高于pcDNA3/sVP1组(P<0.05)。(4)小鼠脾脏淋巴细胞增殖试验分别以CVB3和刀豆蛋白A(concanavalin A, ConA)体外刺激淋巴细胞,检测细胞增殖活性。单因素方差分析表明,以CVB3刺激时,与pcDNA3组和pcDNA3/sVP1组相比,pcDNA3/sVP1-C3d3组的增殖活性显著升高(P<0.05);以ConA刺激时, pcDNA3/sVP1-C3d3组和pcDNA3/sVP1组均显著高于pcDNA3组(P<0.05),但这两组之间相比无统计学差异。(5)小鼠脾脏特异性CTL杀伤活性经单因素方差分析表明,pcDNA3/sVP1-C3d3免疫组在所有实验组中杀伤活性最高,而pcDNA3免疫组则最低,两两比较P<0.05。(6)用5LD50攻击小鼠,各组21天生存率分别为:pcDNA3/sVP1-C3d3组50%,pcDNA3/SVP1组25%,pcDNA3组无生存。但经χ2检验,两两比较差别无统计学意义。用Kaplan-Meier法进行生存分析表明,各组生存率曲线分布有差别(P<0.05),进一步两两比较说明pcDNA3/sVP1-C3d3组小鼠的生存状况好于pcDNA3组( P<0.05 ),但pcDNA3/SVP1-C3d3组与pcDNA3/sVP1组比较差异无统计学意义。(7)与两个对照组相比,pcDNA3/sVP1-C3d3组小鼠血中病毒滴度显著降低(P<0.05)。(8)心肌病理学检查发现pcDNA3/sVP1-C3d3组较对照组心肌病理学变化均有所减轻,但各组之间并无明显差别。结论:(1)通过限制性内切酶双酶切成功得到C3d3基因片段。(2)成功构建真核表达质粒pcDNA3/sVP1-C3d3。(3)用致死量CVB3攻击小鼠后,经pcDNA3/sVP1-C3d3免疫后的小鼠生存率有所提高,Kaplan-Meier生存分析表明pcDNA3/ sVP1-C3d3组的生存状况优于pcDNA3组。(4)小鼠血中中和抗体滴度随免疫次数的增加而提高,三次免疫后C3d能够显著提高sVP1基因免疫所诱导的中和抗体水平。(5) pcDNA3/ sVP1-C3d3能够增强小鼠淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤水平。(6)中和抗体滴度、特异性淋巴细胞增殖指数、CTL杀伤率、血中病毒滴度和心肌切片病理学分析结果和小鼠生存率一致,说明C3d可以显著增强sVP1基因免疫诱导的特异性免疫应答,但其对于小鼠受到致死量病毒攻击时的免疫保护作用尚不能达到满意效果。