人CD34<'+>干/祖细胞异常表达基因hCLP46功能的初步探讨、原核表达及抗体制备

来源 :中国科学院研究生院 中国科学院大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhuyuyuseu
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hCLP46(human CAP10-1ike protein46KD)是本课题组从MDS-AML的CD34+细胞cDNA文库中筛选出的新基因,为了进一步探讨该基因的功能,本实验利用RT-PCR技术证明hCLP46(1195bp)基因在人脑组织中有表达,而在人胚胎肝组织中无表达。将脑组织中的RT-PCR产物经过测序分析显示,该基因序列与GenBank(Accession Number∶AY298903)中的由111个ESTs重叠群组装成的hCLP46基因完全相同。将该基因构建到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,质粒经过转染U937细胞,发现过量表达该基因的U937细胞能够抑制TGF-β对p15基因的上调。此外,利用生物信息学手段对该基因进行序列分析,发现其启动子区存在一个典型的“CpG island”。提示该基因有可能参与甲基化调节途径。   将hCLP46基因构建到连接一非依赖型载体pET-32Xa/LIC,将此质粒转入到表达菌株Rosetta(DE3)pLysS,建立了该基因的pET原核表达体系,经IPTG诱导后,细胞裂解物经组蛋白亲和层析柱分离纯化,证明得到融合蛋白His-hCLP46;同时将hCLP46基因构建到pMAL-c2x载体上,转化表达菌株Rosetta,用IPTG诱导蛋白表达后经Amylose亲和柱分离纯化,证明得到可溶性融合蛋白MBP-hCLP46。   用MBP-hCLP46做为抗原免疫家兔,Western bloting结果确认得到了抗MBP-hCLP46多克隆抗体。用His-hCLP46融合蛋白免疫Balb/c小鼠,用于制备抗His-hCLP46多克隆抗体,经三次免疫后间接ELISA法测定效价,结果显示抗体效价达到1∶2000。细胞融合、亚克隆工作正在进行中。
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