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副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种嗜盐性细菌，广泛存在于近岸海水、海底沉积物和鱼类、贝类等海洋生物中，是沿海地区引起食物中毒的重要病原菌，食用副溶血弧菌污染的水产品极易引起食物中毒。本文应用特异性鸡IgY(Yolk immunoglobulin)和兔IgG(immunoglobulin G)抗体，建立了6种检测副溶血弧菌的ELISA方法，并进行研究和比较，对最佳检测方法进行了应用研究。主要研究结果如下：
1.抗体的提取和纯化
采用水稀释法粗提IgY抗体，再经硫酸铵盐析和Sephadex G100凝胶层析纯化IgY抗体，纯化后IgY(10mg/mL)的效价为1:14400，效价比纯化前提高了4倍。IgG通过辛酸-硫酸铵和DEAE-Sepharose FF离子交换层析联用的方法，纯化后IgG抗体（10mg/mL）效价达到1:204800，比纯化前提高了8倍。
2.酶标IgG和酶标IgY的制备
采用改良的过碘酸钠法制备酶标记物，用HRP分别标记纯化的IgG和IgY抗体，酶标抗体HRP-IgG和HRP-IgY的标记率分别为42.7％和32.2％。
3.建立6种ELISA方法检测副溶血弧菌
确定了6种检测副溶血弧菌的ELISA方法的工作条件、最低检出限、特异性及重复性。
(1)以酶标IgG为抗体建立直接ELISA方法
建立直接ELISA方法的酶标IgG抗体的工作浓度为100μg/mL，对副溶血弧菌的检出限为5×105cfu/mL。
(2)以IgG为抗体建立间接ELISA方法
建立间接ELISA方法的IgG抗体（初始浓度10mg/mL）的工作浓度为1:1600，HRP-羊抗兔IgG的最适工作浓度为1:2000，抗原和IgG抗体反应时间为75min，最低检出限为1.0×106cfu/mL。
(3)以酶标IgG为抗体建立dcELISA方法
以酶标IgG为抗体建立dcELISA方法的抗原包被浓度为107cfu/mL，酶标抗体工作浓度为20μg/mL，采用板外预混30min后室温(25℃)反应15min，副溶血弧菌抑制中浓度(IC50)为2.26×106cfu/mL，最低检出限为1.19×104cfu/mL，最佳检测范围为2.01×104～2.55×108cfu/mL.
(4)以酶标IgY为抗体建立dcELISA方法
以酶标IgY为抗体建立的dcELISA方法的抗原包被浓度为5×107cfu/mL，酶标抗体工作浓度为40μg/mL，采用板外预混30min后室温(25℃)反应15min，副溶血弧菌抑制中浓度(IC50)为4.29×106cfu/mL，最低检出限为1.30×104cfu/mL，最佳检测范围为2.32×104～7.91×108cfu/mL。
(5)以IgY为捕获抗体，HRP-IgG为检测抗体，建立双抗夹心ELISA方法I
双抗夹心ELISA方法I的捕获抗体IgY的最适工作浓度为20～80μg/mL，酶标检测抗体HRP-IgG的最适工作浓度为50μg/mL，IgY包被条件为37℃包被1h或者微波最小火力包被5min，不封闭，其它反应条件为：捕获抗体IgY与抗原于37℃结合2h，酶标检测抗体HRP-IgG与抗原于37℃结合1h。该方法对副溶血弧菌的检出限为2.13×104cfu/mL。
(6)以IgG为捕获抗体，HRP-IgY为检测抗体，建立双抗夹心ELISA方法Ⅱ
双抗夹心ELISA方法Ⅱ的捕获抗体IgG(初始浓度10mg/mL)的最适稀释度为1:12800，酶标检测抗体HRP-IgY(初始浓度9mg/mL)的最适稀释度为1:200，其它反应条件为：IgG抗体采用37℃包被lh，不封闭，捕获抗体IgG与抗原于37℃结合2h，酶标检测抗体HRP-IgY与抗原于37℃结合lh。该方法对副溶血弧菌的检出限为8.69×104cfu/mL。
上述6种ELISA方法对检测副溶血弧菌均有良好的特异性和重复性。
4.稳定性研究
在建立副溶血弧菌双抗夹心ELISA法的同时，对于抗体包被板的稳定性以及酶标抗体的稳定性进行了测定。结果表明：IgY抗体包被的板能在2～8℃放置45d，IgG抗体包被的板能在2～8℃放置7个月左右；酶标IgG和酶标IgY加等量甘油或1％BSA在4℃条件下可分别放置至少4个月、3个月左右，在-20℃条件下，可分别放置4个月、3个月左右。
5.双抗夹心ELISA方法I检测水产品中副溶血弧菌的应用
经比较，六种方法中双抗夹心ELISA方法I是最佳的检测方法。在黄花鱼、黄立昌鱼、基围虾样品中加入副溶血弧菌，使样品中副溶血弧菌的含菌量分别为0.1cfu/mL、1cfu/mL和10cfu/mL，然后于含3％ NaC1的LB培养液中，30℃，150r/min摇床中增菌。用双抗夹心ELISA方法I检测，含菌量为0.1cfu/mL时，基围虾和黄立昌鱼在增菌8～10h后检测呈阳性，黄花鱼增菌10h后检测呈阳性；含菌量为1cfu/mL时，基围虾和黄立昌鱼在增菌8h后检测呈阳性，黄花鱼增菌8～10h后检测呈阳性；含菌量为10cfu/mL时，基围虾和黄立昌鱼在增菌6～8h后检测呈阳性，黄花鱼增菌8h后检测呈阳性。