酶法拆分制备D-丝氨酸以及近红外在线监控酶法转化制备γ-氨基丁酸

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20世纪初期人类发现了味精,并开始使用发酵法大规模地生产各种常见氨基酸,到了21世纪氨基酸产业经历了100年的发展,由于高能耗以及行业间的价格打压,氨基酸产业慢慢地被少数几家大公司所垄断。然而小品种氨基酸包括各类D型氨基酸由于其独特的生理生化功能,已经被制成多种类型的保健品,开始被人们慢慢地接受,逐渐受到重视。小品种氨基酸刚刚起步,由于无法使用传统发酵大规模生产,因此生产工艺尚待开发。  论文采用最新的基因工程技术,制得高丝氨酸羟甲基转移酶活力的菌体细胞,为L-丝氨酸的合成提供上游技术支持。使用实验室之前克隆表达的色氨酸酶,为下游同时生产D-丝氨酸及L-色氨酸提供了绿色的合成思路。沿用实验室之前克隆表达的高活力谷氨酸脱羧酶,为γ-氨基丁酸的中试生产提供了指导性的建议。同时使用近红外光谱分析技术对γ-氨基丁酸的酶促转化制备过程进行了实时监控,为小品种氨基酸的酶法转化清洁生产以及在线监控奠定了基础。  本论文首先以E.coli BL21(DE3)菌株基因组DNA为模板,设计引物进行PCR扩增丝氨酸羟甲基转移酶基因。构建重组载体pET-21 a(+)-SHMT,在基因水平、蛋白水平和酶活力测试中,同时证明了该酶的成功表达,克隆表达出来的丝氨酸羟甲基转移酶活力是正常E.coli BL21(DE3)菌株活力的10倍。  在使用色氨酸酶催化D,L-丝氨酸和吲哚制备L-色氨酸和D-丝氨酸时,应用响应面分析法对合成条件进行了优化,得到了酶法合成的最优条件:色氨酸酶质量浓度为6g/L,D,L-丝氨酸质量浓度30 g/L,吲哚60 g/L,反应温度45℃,反应pH8.0,反应时间18 h,经过两次转化,产物L-色氨酸的总转化率可达95.4%。D-丝氨酸的,比旋光度-15.3°(C=10,2N HCl)同标准品D-丝氨酸一致,化学纯度为99.4%,提取分离的总回收率为66.6%。  对以L-谷氨酸为底物利用谷氨酸脱羧酶酶法制备γ-氨基丁酸的合成条件进行优化,得到了酶法合成的最优条件:高产谷氨酸脱羧酶细胞液以2.48 g/(L·h)的速度流加4.33h,终酶量达到10.7 g/L,反应在5h即可完成。同时使用近红外光谱分析技术实时监控反应过程,为了克服不溶性底物以及混悬菌体细胞液的干扰,设计了19μm和0.2μm的串联过滤膜系统,得到了澄清液体的近红外模型,L-谷氨酸浓度范围在3.54 g/L-41.91g/L波动条件下的预测精度(RMSEP)为1.58 g/L,γ-氨基丁酸在7.05 g/L-125.52 g/L的波动条件下预测精度(RMSEP)为3.07 g/L。最后对10L反应体系下的转化液进行分离提取,产品总收率70%,而且产品质量符合日本味之素企业标准AJI92。
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