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背景： 恶性肿瘤的发生在全世界范围内都是一个严重的健康问题。目前为止，手术切除仍然是实体肿瘤患者最主要的治疗方式。肿瘤的TNM分期分型被广泛的应用于术后病人的预后估计和辅助治疗合理性评价。尽管在预测患者预后方面，TNM分期系统表现出一定的参考价值，但是仅仅依赖于肿瘤组织的病理学特征进行判断仍然不够准确。另一方面，绝大多数的人类实体肿瘤都伴随着淋巴细胞的浸润，并且长久以来，研究者一直认为通过对免疫应答的检测可能可以用来预测肿瘤的进展以及评价治疗的效果。但是，受制于抗肿瘤免疫应答的系统性和复杂性，利用组织标本进行的免疫监视始终缺乏实用性，并且其结果亦不够可靠。得益于系统生物学和高通量检测方法的进步，通过监视免疫应答评价肿瘤患者生存已经变为可能。然而，现有的新的免疫标志物仍然不够理想，其可靠性和准确性都需要进一步的确认。 人类肿瘤内淋巴细胞的浸润是一种普遍的病理现象，并且被认为是免疫监视功能的重要的体现。在抗肿瘤免疫应答的过程中，幼稚T淋巴细胞被递呈的肿瘤相关抗原/肿瘤特异性抗原活化，接着进入外周组织开始进一步的分化并收敛形成免疫记忆。现有假设认为，肿瘤相关抗原特异性的记忆T细胞在肿瘤术后病人的免疫监视中发挥了重要的功能，阻碍肿瘤患者的复发。但是，组织驻留的记忆T淋巴细胞对抗肿瘤复发的监视能力仍然不清楚。 当与抗原提呈细胞相遇的时候，T细胞会识别抗原提呈细胞表面的肽段，并且这一过程具有显著的特异性和灵敏性。T淋巴细胞应答的特异性很大程度上来源于 T细胞受体与抗原肽-MHC复合物的亲和力强弱。T淋巴细胞在胸腺内的早期发育过程中，TCRA和TCRB基因座位通过体细胞重组产生TCR多样性。在不同片段之间编码的DNA序列编码的区域叫做互补决定区3（CDR3）。这一区域对抗原肽有着最强的结合能力，并且是 TCR特异性和抗原识别的决定性因素。因此，T细胞接到的抗肿瘤免疫应答最核心的特征–抗原特异性 T细胞克隆的局部扩增，以及随后的肿瘤内T细胞受体库的群体水平的漂移–可以通过CDR3的克隆富集和多样性来反映。 传统的分析方法包括基于特异性抗体的流式细胞仪检测，基于PCR扩增的CDR3长度分布谱分析等。这些方法都只能为肿瘤内T细胞受体库的组成提供非常有限的信息。最近，通过高通量测序进行的T细胞受体库分析已经提供了系统全面的数据来理解获得性免疫应答的过程。在这项研究中，我们通过一组胃癌病人来研究肿瘤内 T细胞受体库组成特征与病人预后的关系。我们发展了一种TCRB测序方法，可以均衡测序通量的需要和经济花费，使大规模的临床样品筛查成为可能。通过数据挖掘，我们尝试回答下列问题：1，肿瘤浸润T淋巴细胞受体库的扩增和多样性变化；2，肿瘤内扩增T细胞克隆的来源和转归；3，T细胞受体库和患者临床预后之间的关系。 结果： 1．TCR深度测序技术用于冰冻组织样品的免疫组库检测 为了更好的理解T细胞参与抗肿瘤免疫应答的相关机制，我们发展了一种基于高通量测序技术的TCR组成分析方法。这一技术方案可以使用很少量的临床样品完成TCR的测序工作，并且同时平衡经济上的可承受性和测序深度的需要。通过对覆盖深度和测序重复性的检测，我们证明了该测序方案可以有效的覆盖待测样品中的高频率克隆。并且，我们同时发现在没有免疫刺激的条件下，T细胞群体中的高频克隆的频率十分稳定。 2．胃癌患者的个体间差异可能掩盖CDR3分布差异 通过对胃癌患者肿瘤组织，癌旁黏膜和外周血的测序，我们测定了不同样品的CDR3长度分布，并且发现不同组织的TCR CDR3长度分布没有显著差别。此外，通过对患者外周血和健康对照外周血的比较，我们依然没有发现TCR CDR3长度上的区别。 3．肿瘤浸润T细胞中含有大量高扩增克隆 在患者肿瘤组织T细胞受体库中，频率最高的10％的克隆占据了T细胞全体的73.7%；而对于癌旁粘膜和外周血，其频率最高的10%的克隆分别占全部T细胞群体的57.3%和69.4%。此外，在群体水平上，不同组织内高频克隆的比例也有显著的差别（TCRB NT克隆，肿瘤内19.3%±12.5%；粘膜内5.1%±5.6%，外周血内7.4%±6.5%；CDR3 AA克隆，肿瘤内34.0%±19.0%；粘膜内10.8%±9.1%，外周血内14.0%±12.0%）。 4．肿瘤浸润T细胞受体库多样性下降 通过计算NSDE多样性系数，与癌旁粘膜和外周血内的TCR库相比，肿瘤内浸润T细胞受体的多样性显著下降，并且这一结论对于TCRB NT克隆和CDR3 AA克隆同时成立（TCRB NT克隆，肿瘤内0.84；粘膜内0.92，外周血内0.90；CDR3 AA克隆，肿瘤内0.77；粘膜内0.88，外周血内0.86）。 5．肿瘤内高扩增克隆呈现抗原驱动扩增特征 通过进一步分析我们发现，对于所有组织内T细胞克隆来讲，频率更高的克隆，且CDR3区域氨基酸序列的核酸编码程度通常也更复杂，提示我们抗原驱动扩增事件在不同组织内均有发生。但是，我们同时发现在肿瘤内的高频 T细胞克隆的频率显著高于对照组织内（平均克隆频率为肿瘤内0.98%，粘膜内0.73%，外周血内0.80%），并且其CDR3区域氨基酸序列的核酸编码方式也更为复杂（平均CDR3编码方式为肿瘤内17，粘膜内14，外周血中15）。肿瘤高频率肿瘤内T细胞克隆的复杂CDR3编码方式提示我们高扩增克隆可能是在肿瘤相关抗原驱动下增殖的。 6．粘膜内T细胞主要由组织滞留性T记忆细胞组成 为了了解粘膜内T细胞的免疫表型，我们取新鲜粘膜组织样品进行 T细胞单细胞分离，之后通过流式细胞仪进行免疫表型的检测。我们的数据显示，粘膜内 CD3阳性细胞中CD8阳性与CD阴性（绝大部分为CD4阳性）T细胞的比例接近于1：1。对于CD8阳性T细胞，超过2/3的都是CD103hiCD45RO+CD69hiCD62L- CD8+ T细胞，这一表型与现有的对于滞留性T记忆细胞的认识相一致。 7．粘膜内T细胞受体库多样性与患者预后呈正相关 粘膜内 T细胞受体库的多样性系数对于胃癌患者的长期生存和短期生存都有一定的预测作用：粘膜内T细胞群体多样性较低的患者其临床预后也越差。进一步的，通过COX多因素方差分析发现，本研究中粘膜内TCR多样性系数是胃癌患者临床预后的独立相关指标，与患者的其他临床特征无相关性。 结论： 1．TCR深度测序技术用于冰冻组织样品的免疫组库检测； 2．胃癌患者的个体间差异可能掩盖CDR3分布差异； 3．肿瘤浸润T细胞中含有大量高扩增克隆； 4．肿瘤浸润T细胞受体库多样性下降； 5．肿瘤内高扩增克隆呈现抗原驱动扩增特征； 6．粘膜内T细胞主要由组织滞留性T记忆细胞组成； 7．粘膜内T细胞受体库多样性与患者预后呈正相关。