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microRNA(miRNA)是一类内源的、广泛存在于植物和动物中的长约19～26个核苷酸的小RNA,通过碱基配对与编码蛋白的mRNA转录本结合,从而在转录后水平负调控基因的表达。从第一个miRNA在线虫中被发现以来,越来越多的研究表明miRNA在细胞分化、增殖、凋亡和个体发育、疾病发生中行使着重要的功能。miRNA的研究为我们理解人类发育和疾病中复杂的基因调控网络提供了全新的层次。然而,我们对于单一miRNA所参与的信号路径的阐释还处于起步阶段,利用斑马鱼、小鼠等与人类器官发生和信号路径高度保守的脊椎动物,建立稳定的miRNA敲除动物模型以研究miRNA的功能的研究则屈指可数。
我们以斑马鱼作为模式生物,研究一个进化上高度保守的红细胞特异表达的miRNA--miR-144在造血发育中的功能和分子机制。在第一部分的研究中,我们采用了已经在体内和体外研究中被证实能高效、特异敲低miRNA表达的锁核苷酸(LNA)技术,敲低斑马鱼中miR-144的表达。我们发现,敲低miR-144能选择性上调原始红系造血中胚胎期血红蛋白α-珠蛋白的表达,而对β-珠蛋白的表达没有影响。为了寻找miR-144生理背景下的靶基因,我们首先通过生物信息学预测,然后通过体内荧光报告系统和稳定的转基因荧光报告系实验验证,最终确定了miR-144在生理背景下靶向一个红系特异的Krüpple样锌指转录因子家族成员,k1fd(负性调控)。斑马鱼全胚胎染色质免疫沉淀实验(E-chip)证实,K1fd通过直接与胚胎期α-珠蛋白基因启动子区远端的CACCC盒结合,激活α-珠蛋白的表达(正性调控)。有趣的是,K1fd还能作用于miR-144基因启动子区的CACCC盒,激活miR-144的表达(反馈调控)。这样形成了一个以miR-144“刹车”为中心,同时存在正性调控、负性调控和反馈调控三种调节方式的精细调控网络,在红细胞发育过程中维持α-珠蛋白水平的稳定。该研究为理解体内血红蛋白合成平衡的遗传学机制提供了重要线索,同时为临床相关血红蛋白合成调控异常的疾病如地中海贫血提供潜在的治疗靶点。
在第二部分的研究中,为了进一步研究miR-144在定向红系造血中的功能,我们采用了一种全新的能在体外和体内系统中特异敲除基因的技术--锌指核酸酶(ZFN)技术。我们从OPEN锌指文库中筛选靶向miR-144的锌指核酸酶(ZFN),并成功获得了一对能介导斑马鱼体细胞miR-144基因敲除的锌指核酸酶(ZFN)。目前我们正在进行miR-144基因突变生殖系founder的筛选工作,已经筛选到了8个miR-144基因突变的斑马鱼转基因鱼系,有趣的是其中4个founder的基因组序列改变是一样的。这些founder的基因组序列改变包括了发生在miR-144的种子序列、成熟序列和侧翼序列中的碱基插入和缺失,为我们研究miR-114在定向造血中的功能和miRNA不同区域序列与miRNA功能的关系提供了宝贵的资源。